MEF小鼠胚胎成纤维细胞

背景^[1-6]

MEF小鼠胚胎成纤维细胞是将小鼠的胚胎成纤维细胞（MEF）从机体中取出，经胰酶、螯合剂（常用EDTA）处理，分散成单细胞，置MEF生长培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。

原代MEF小鼠胚胎成纤维细胞具体操作：

1.处死孕鼠，全身置于75%酒精里浸泡，然后在超净台中用剪刀和镊子将孕鼠皮肤剪开，用另外一组剪刀、镊子剪开腹部肌层，露出子宫，最后用第三组剪刀和镊子将子宫小心取出放在盛有D-PBS的玻璃平皿中，冲洗去血。

2.用两把弯镊子将胚胎外的胞膜小心去除，然后夹掉头和内脏，将其余胚胎转移到一个装有30 ml D-PBS的50 ml离心管中，轻轻颠倒两次，倒掉D-PBS，再重复此步骤一次，注意要留少许D-PBS，然后将胚胎转移到另一装有D-PBS的平皿中，并用手术刀片将其细细切碎。

3.用200 ul的移液枪反复、快速地吹打平皿中的液体，转移至15 ml离心管中，于4℃1500 rpm离心5分钟，倒掉上清，以10 ml胰酶重悬沉淀，放在37℃水浴中消化30分钟，且每隔五分钟轻轻晃动，使之充分消化。

4. 将上层细胞悬液倒入一个装有10 ml MEF生长培养基的50 ml离心管中，用200目的尼龙网过滤后，以1 500 rpm离心5分钟收集细胞，再用30 ml MEF生长培养基洗涤两次。

5.细胞沉淀用15 ml MEF生长培养基重悬后进行细胞计数(一般8只14天的胎鼠可获得2-3x10细胞)。细胞悬浮于15 ml MEF生长培养基中，接种到200 ml培养瓶中。

7.24小时后更换新鲜的MEF生长培养基。

8.细胞长满后，先用D-PBS冲洗，倒掉后加胰酶消化(此步时间不宜过长，作者一般不超过五分钟)，按1:5传代。

9.细胞再次长到覆盖率80-90%左右，将其消化后，常规冻存(冻存液要现配)。

注意事项：1.原代培养，一定要避免污染。2.MEF生存能力有限，如果不冻存，体外存活十代左右。小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)原代培养可应用于：（1）细胞保种；（2）分子生物学研究；（3）基因治疗相关研究。

应用^[7][8]

小鼠胚胎成纤维细胞体外培养与生长特性的研究：

许多胚胎干（ES）细胞培养方案依赖于单层原代小鼠胚胎成纤维细胞（MEF饲养细胞）的使用。MEF细胞在干细胞培养中发挥两个重要作用：它们会向培养基中分泌几种有助于维持其多能性的重要生长因子，并为ES细胞生长提供细胞基质。EmbryoMax™系列PMEF小鼠饲养细胞为研究人员提供了ES细胞培养的便捷解决方案，省去了耗时的饲养细胞分离和制备过程。

这些细胞来源于第13天的小鼠胚胎，被冷冻成单独西林瓶，每瓶大约含有5-6 x 106个成纤维细胞，并以每组5瓶、每瓶传代数不同（P1-P3）的形式出售。有几种品种可供选择，包括耐药，抑制生长，和未经丝裂霉素-C处理的小鼠饲养细胞。饲养层(feeder layer)是特定的细胞(如成纤维细胞、输卵管上皮细胞、子宫上皮细胞、胎儿睾丸细胞等)经丝裂霉素-C阻断有丝分裂处理后制成的单层细胞。

目前，大多数实验室均采用小鼠成纤维细胞(MEF和STO细胞)作为饲养层分离培养胚胎干细胞(ES)。饲养层的存在不仅为ES细胞的生长繁殖提供了一个稳定的外环境，同时也维持了ES细胞无限增殖与分化的特性。然而衰老的饲养层会对ES细胞产生负面影响，死亡的饲养层细胞会释放一些DNA碎片和溶酶体的酶进入培养液，干扰了ES细胞的生长和正常核型的维持。

利用3种不同的冷冻方法对小鼠胚胎成纤维细胞进行冻存，筛选出的冷冻方案。并对小鼠胚胎成纤维细胞在连续传代过程中细胞活力以及细胞骨架所发生的变化进行追踪观察，确定制作饲养层的时机。本试验首先以12.5d的昆明小鼠胚胎和STO细胞为材料，对MEF进行了分离培养。并通过3种冷冻方法对STO细胞和MEF细胞分别进行冷冻，即方法A为将细胞在冰箱中平衡1h后放入-20℃冰箱中过夜，次日转移至液氮中；方法B为将细胞迅速放入-70℃冰箱过夜，次日转移至液氮中；方法C为将细胞置于液氮面上5-10cm处薰蒸20min后缓缓降入液氮中。

细胞冻融后再以存活率(台盼蓝染色实验)为主，辅以细胞相对活力测定(MTT法检测)和冷冻前后的细胞形态比较，对这3种方法的冷冻效果作以比较。以其为小鼠成纤维细胞的保存提供依据。然后对STO细胞和MEF细胞进行了连续培养，观察其形态学变化，采用MTT法检测其细胞活力，并绘制了细胞生长曲线；对不同代次的小鼠胚胎成纤维细胞进行免疫荧光染色，观察其细胞骨架的变化。

参考文献

[1]production of malignancy in vitro.Earle WR,,Schilling EL,Stark TH,et al.Journal of the National Cancer Institute.1943

[2]Nutrition needs of mammalian cells in tissue Culture.Eagle H.Science.1995

[3]Prospects for the commercial cloning of animals by nuclear transplantation.Robi JM.,and Stice SI.Theriogenology.1989

[4]Complementary tissue-Specific expression of LIF and LIF-receptor mRNAs in early mouse embryogenesis.Nichols J,Davidson D,Taga T,et al.Mechanisms of Development.1996

[5]Animal Cell Biotechnology Methods and Protocols.Jenkins N..1999

[6]Understanding and managing cell culture contamination.Ryan J..1994

[7]Titers of nine complement components,conglutinin and C3binactivator in adult and fetal bovine sera.Linscott WD.Molecular Immunology.1980

[8]卢晓.小鼠胚胎成纤维细胞体外培养与生长特性的研究[D].南京农业大学,2007.