大牛血清的应用

背景^[1-6]

大牛血清采用成年健康大牛血液为原料加工而成，经无菌采集、分离、微孔过滤分装而成。标准大牛血清（成牛血清）本产品无支原体、无牛病毒、无噬菌体，低内毒素，最终过滤孔径0.1um。

大牛血清质量标准：

血清质量高低取决于两方面因素：一是取材对象，二是取材过程。用于取材的动物应健康无病并且在指定的出生天数之内，取材过程应严格按照操作规程执行，制备出的血清要经过严格的质量鉴定。

1.牛血清必须来自有文件证明无牛海绵状脑病的牛群或国家。并应具备适当的监测系统。

2.有些国家还要求牛血清来自未用过反刍动物蛋白饲料的牛群。

3.证明所用牛血清中不含对所生产疫苗病毒的抑制物。

4.血清要通过滤膜过滤除菌，保证无菌。

5.无细菌、霉菌、支原体和病毒的污染，有些国家要求无细菌噬菌体污染。

6.对细胞有良好的支持繁殖作用。

大牛血清在细胞培养中作用：

提供基本营养物质：氨基酸、维生素、无机物、脂类物质、核酸衍生物等，是细胞生长必须的物质。提供激素和各种生长因子：胰岛素、肾上腺皮质激素（地塞米松）、类固醇激素（雌二醇、睾酮、孕酮）等。生长因子如成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血小板生长因子等。

提供结合蛋白：结合蛋白作用是携带重要地低分子量物质，如白蛋白携带维生素、脂肪、以及激素等，转铁蛋白携带铁。结合蛋白在细胞代谢过程中起重要作用。提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤。

对培养中的细胞起到某些保护作用：有一些细胞，如内皮细胞、骨髓样细胞可以释放蛋白酶，血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用。这种作用是偶然发现的，现在则有目的的使用血清来终止胰蛋白酶的消化作用。因为胰蛋白酶已经被广泛用于贴壁细胞的消化传代。血清蛋白形成了血清的粘度，可以保护细胞免受机械损伤，特别是在悬浮培养搅拌时，粘度起到重要作用。血清还含有一些微量元素和离子，他们在代谢解毒中起重要作用，如SeO3,硒等。

应用^[7][8]

大牛血清适用于诊断试剂生产，医学研究等：

弓形虫病（Toxoplasmosis）是由弓形虫（Toxoplasma gondii）引发的人兽共患的寄生虫病，它可感染人类和多种哺乳动物，呈世界范围分布，严重危害人类健康和畜牧业的发展。人类可通过食入未煮熟或含有组织囊肿或卵囊污染的食物感染弓形虫。牛感染弓形虫后所携带囊肿组织将会传播给人类，因此准确的检测牛感染弓形虫的情况具有重要的公共卫生意义。弓形虫致密颗粒蛋白（GRAs）为一类分泌型蛋白，它是潜在的弓形虫病诊断抗原。

通过cDNA文库免疫筛选的鉴定，GRA7是弓形虫致密颗粒蛋白家族中的一员，基因全长750bp，可作为血清学诊断弓形虫病的标志物。弓形虫GRA7基因原核表达与纯化将GenBank已发表的弓形虫GRA7序列去除信号肽后设计并合成一对特异性引物，通过RT-PCR技术扩增弓形虫GRA7基因，结果获得一条675bp目的片段，将此片段克隆到T载体，经酶切鉴定和测序分析筛选，结果与已公布的弓形虫GRA7基因序列同源性为100%。

构建原核表达载体pET-28a-GRA7，转化大肠杆菌，IPTG诱导，经SDS-PAGE和Western blotting分析，重组GRA7分子量为27kDa。应用Ni-NTA对表达蛋白进行纯化，重组GRA7浓度达0.6mg/ml。弓形虫ELISA检测方法建立应用纯化的重组GRA7蛋白为抗原包被酶标板，建立了弓形虫牛血清ELISA检测方法，抗原包被浓度为5μg/ml、血清稀释度为1:100，封闭液为5%脱脂奶粉，二抗工作浓度为1:20000，TMB显色的时间为20min。

将血清稀释至1:12800，可以检测出弓形虫阳性，批内、批间重复性变异系数均值分别为4.70%、3.51%，小于8%，说明该法灵敏度高，重复性好。应用该方法检测牛带绦虫、肉孢子虫、包虫和牛弓形虫阳性血清，结果表明该ELISA检测方法与其他牛寄生虫病阳性血清无交叉反应，具有良好的特异性。用建立的ELISA方法检测100份牛血清，将其与Dot-blot检测结果进行比较，符合率达到92%。本研究建立的ELISA检测方法为试剂盒的开发奠定前期基础，为我国牛弓形虫病的诊断提供技术手段。

参考文献

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[5]Toxoplasma gondii:An evaluation of diagnostic value of recombinant antigens in a murine model[J].Justyna Gatkowska,Elzbieta Hiszczynska-Sawicka,Jozef Kur,Lucyna Holec,Henryka Dlugonska.Experimental Parasitology.2006(3)

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[8]葛巍.弓形虫致密颗粒蛋白GRA7基因的原核表达及牛血清ELISA检测方法的建立[D].吉林农业大学,2014.