小鼠组织直接PCR试剂盒

背景^[1-6]

小鼠组织直接PCR试剂盒是一款可快速对小鼠鼠尾、鼠耳、肌肉等组织样本进行PCR扩增的试剂盒。本试剂盒采用独特的裂解缓冲液体系，可以快速的裂解样品并释放出基因组DNA，不需要除去蛋白、RNA等，即可将释放出的基因组DNA作为模板直接用于PCR反应。此外，样品使用量少，低至5mg小鼠组织或2-5mm鼠尾即可进行实验。

小鼠组织直接PCR试剂盒中提供的2×Mouse Master Mix具有很强的扩增兼容性，能直接以待测样品裂解液为模板，进行高效特异性扩增。该试剂为2倍浓缩PCR反应混合液，包含了用于PCR扩增除模板和引物外的所有组分，大大简化操作过程，降低污染几率。

操作方法：样品基因组DNA释放

1.在离心管中加入100μL Buffer MP，4μL Protease Plus，轻轻涡旋混匀。

【注】：Buffer MP与Protease Plus混合后尽快使用，不宜长期保存。

2.取5-10mg动物组织或2-5mm鼠尾，置于上述离心管中，轻轻涡旋混匀。

【注】：组织应尽量剪碎，以便酶解反应更顺利进行。

3.65℃孵育10-30min，然后95℃处理5min。

【注】：65℃孵育，一般10min即可满足多数PCR需求。若需要的DNA量较大或样品较难酶解，可将时间延长至30min。组织块不需完全酶解，残余的部分在后续离心步骤中可被除去。

4.12000rpm离心5min。

5.将上清转移至新的离心管，4℃或-20℃保存或直接用于PCR扩增。

对照反应：

在PCR结果分析时，不管是阳性结果或阴性结果，如果没有对照反应，都不能确定结果是否可靠。为了便于后续实验结果的分析，建议在进行PCR时，设置阳性和阴性PCR对照反应以便于排除假阳性或假阴性的干扰。

注意事项：

1.为了避免样本间交叉污染，每次取样后都需要将取样器材的刃口或与样本直接接触的部位浸入2%次氯酸钠溶液中，反复洗刷数次进行清洗，然后用干净的纸巾擦干残余液体后再进行使用。为了试验方便，也可准备多个取样器材，在使用完后进行统一清洗，确保每一单独样本均使用的是无污染的取样器材。

2.建议使用新鲜采取的动物组织，若为长期冷冻组织，应尽量避免反复冻融，否则会导致模板的降解，影响PCR效率。

3.试剂Buffer MP若低温保存，易产生沉淀。在使用前务必将其在室温中放置一段时间，也可在37℃水浴中预热10min，以溶解沉淀，混匀后再使用。

4.电泳检测时，切勿使用含有SDS的Loading Buffer。否则，电泳时会在泳道中出现一大团拖尾亮带，影响实验结果。

5.为了安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

应用^[7][8]

小鼠组织直接PCR试剂盒可用于小鼠组织快速PCR检测：

小鹅瘟病毒(GPV)VP3基因检测方法、GPV的VP3基因疫苗及GPV弱毒疫苗免疫小鼠以后在机体分布及表达等开展了以下研究：

①特异性检测小鹅瘟病毒(GPV)VP3基因的荧光定量PCR(FQ-PCR)的建立；②将GPV-VP3基因疫苗(pcDNA-GPV-VP3)分别以每只200μg、100μg、50μg肌肉注射和6μg、3μg、1μg基因枪轰击的方法免疫六组BALB／c小鼠；将GPV弱毒疫苗以每只100μl通过肌肉注射免疫一组BALB／c小鼠，免疫后不同时间分别取各组小鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑、肠、胃和免疫部位组织(肌肉或皮肤)等组织器官，通过建立的FQ-PCR和免疫组织化学方法检测pcDNA-GPV-VP3及其表达产物和GPV弱毒在BALB／c小鼠体内的动态分布。

获得如下结果：

1．建立的FQ-PCR特异性强、灵敏度高、重复性好，核酸模板数与FQ-PCR测定的Ct值具有很好的直线相关性(相关系数达到0.999)。

2．pcDNA-GPV-VP3免疫小鼠后1-3h后可分布至小鼠体内各组织器官中且含量达到，随后含量下降，但仍能持续存在31wk以上。

3．在肌肉注射pcDNA-GPV-VP3三组中，基因疫苗的剂量和基因疫苗在组织中的含量呈现正相关性，15wk前差异显著(P＜0.05)，但15wk后差异不显著(P＞0.05)；在基因枪轰击pcDNA-GPV-VP3三组中，基因疫苗的剂量和基因疫苗在组织中的含量呈现较弱的正相关性，各剂量之间差异不显著(P＞0.05)。

4．在肌肉注射pcDNA-GPV-VP3三组中，表达产物在心、免疫部位肌肉、肾和肝细胞细胞核中被检测到，基因疫苗的剂量和表达产物的量呈现一定的正相关性；基因枪轰击pcDNA-GPV-VP3三组中，表达产物在心、免疫部位皮肤、肾和肝细胞细胞核中被检测到，基因疫苗的剂量和表达产物的量呈现较弱的正相关性。

参考文献

[1]An Overview of Real-Time Quantitative PCR: Applications to Quantify Cytokine Gene Expression[J] . Annapaula Giulietti,Lut Overbergh,Dirk Valckx,Brigitte Decallonne,Roger Bouillon,Chantal Mathieu.  Methods . 2001 (4)

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[3]DNA vaccines: safety and efficacy issues[J] . Dennis M. Klinman,Mitsuhiro Takeno,Motohide Ichino,Mili Gu,Galina Yamshchikov,Gil Mor,Jacqueline Conover.  Springer Seminars in Immunopathology . 1997 (2)

[4]Gene gun-based nucleic acid immunization: elicitation of humoral and cytotoxic T lymphocyte responses following epidermal delivery of nanogram quantities of DNA[J] . Tamera M. Pertmer,Michael D. Eisenbraun,Dennis McCabe,Sudhirdas K. Prayaga,Deborah H. Fuller,Joel R. Haynes.  Vaccine . 1995 (15)

[5]The Fate of Plasmid DNA After Intravenous Injection in Mice: Involvement of Scavenger Receptors in Its Hepatic Uptake[J] . Kenji Kawabata,Yoshinobu Takakura,Mitsuru Hashida.  Pharmaceutical Research . 1995 (6)

[6] Targeted delivery of plasmid DNA to hepatocytes in vivo: optimization of the pharmacokinetics of plasmid DNA/galactosylated poly(L-lysine) complexes by controlling their physicochemical properties. Nishikawa M,Takemura S,Takakura Y, et al. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics . 1998

[7] Plasmid DNA malaria vaccine: tissue distribution and safety studies in mice and rabbits. Parker S E,Borellini F,Wenk M, et al. Human Gene Therapy . 1999

[8]刘晓东. 小鹅瘟病毒VP3基因疫苗在小鼠体内动态分布与表达的研究[D].四川农业大学,2007.