组织总RNA大量提取试剂盒的操作步骤

背景及概述^[1]

组织总RNA大量纯化试剂盒用于从培养的动物细胞、组织样本、血液、血浆、血清、细菌、酵母、真菌、植物和病毒中快速分离和纯化总RNA。组织总RNA大量纯化试剂盒可纯化任何大小的RNA，从较大的mRNA和rRNA到miRNA和小干扰RNA(siRNA)。组织总RNA大量纯化试剂盒无需使用苯酚或氯仿即可从蛋白等其他细胞组分中优先纯化出RNA。纯化得到的RNA完整性高，适用于多种下游应用，比如实时定量PCR、逆转录PCR、Northern杂交、RNase保护、引物延伸及表达阵列分析。

组织总RNA大量纯化试剂盒采用高效、专一结合核酸的硅胶膜离心吸附柱和独特的缓冲系统，可从动物组织培养细胞中快速提取总RNA，可同时处理大量不同样品。操作简单方便，1小时内完成实验，所提RNA纯度高，没有蛋白和其他杂质污染。如果下游是对微量DNA非常敏感的RNA实验，残留的DNA可利用无RNase的DNase在柱上进行消化去除，可用于构建cDNA文库、RT-PCR、NorthernBlot、DotBlot、polyA筛选纯化、real-timeRT-PCR、体外翻译等实验。

操作步骤^[1]

1.将组织在液氮中磨碎成粉沫。每20~30mg组织加600ulBufferRL（使用前检查是否加入β-巯基乙醇），组织样本少于20mg加350ulBufferRL。样品体积不超过BufferRL体积的十分之一。

2.样品充分裂解后，室温放置5min，使蛋白核酸复合物完全分离。

3.12000rpm离心2~5min，取上清进行下步操作。

4.加入1倍体积（600ul或350ul）的70%乙醇（无RNase水配制），混匀。

5.将步骤4所得溶液全部加入到已装入收集管（CollectionTube2ml）的吸附柱（SpinColumnCR）中，若一次不能将全部溶液加入吸附柱中，请分两次转入，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。

6.向吸附柱中加入350μlBufferRD，10000rpm离心15sec，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。

7.配制DNaseI混合液：取52ulDEPC-H₂O，向其中加入8ul10×DNaseIBuffer和20ulDNaseI（1U/ul），混匀，配制成终体积为80ul的DNaseI混合液。

8.向吸附柱中直接加入80ulDNaseI混合液，20~30℃孵育15min。

9.向吸附柱中加入350ulBufferRD，10000rpm离心15sec，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。

10.向吸附柱中加入500ulBufferRW，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。

11.重复步骤10。

12.12000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。

13.将吸附柱置于一个新的无RNase离心管（CollectionTube1.5ml）中，向吸附柱的中间部位悬空加入30~50ulDEPC-H₂O，室温放置1min，12000rpm离心1min，收集RNA溶液，-70℃保存RNA，防止降解。

主要参考资料

[1] 现代医学实验技巧全书·上册