快速DNA连接模块

背景^[1-6]

快速DNA连接模块是针对Illumina高通量测序平台文库构建专业设计的DNA连接模块。本产品可在双链平末端DNA片段或双链3′-dA DNA片段的两端连接Illumina测序平台适用的DNA接头，具有连接效率高、简便、可实现自动化等优势。

Fast Pace T4 DNA Ligase：

1.SDS-PAGE纯度：>95%。

2.16小时孵育检测：50μL反应体系中包含5μl本酶和1μg HindIII-λDNA，37°C下孵育16小时。经琼脂糖凝胶电泳检测，条带无降解；50μL反应体系中包含5μl本酶和1μg T3 DNA，37°C下孵育16小时。经琼脂糖凝胶电泳检测，条带无降解。

3.RNase活性：5μl本酶中加入40 ng FAM-RNA及，37°C下孵育16小时。经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，条带无降解。

4.核酸内切酶活性：50μL反应体系中加入5μl本酶和1μgφX174 RF I DNA，37°C下孵育4小时。经琼脂糖凝胶电泳检测，RF II转化比率<10%。

5.核酸外切酶活性：50μL反应体系中加入至少5μl本酶和1μg声振的[3H]DNA（105 cpm/μg），37°C下孵育4小时，释放的放射性<0.1%。

6.功能活性（平末端连接）：50μL反应体系，在1×Fast Pace Ligation Buffer中，加入0.5µL Fast Pace T4 DNA Ligase，18μgHaeIIIφX174，16°C孵育7.5分钟。经琼脂糖电泳检测，片段连接率>95%。

7.功能活性（接头连接）：50μL反应体系，在1×Fast Pace Ligation Buffer中，加入0.125µL Fast Pace T4 DNA Ligase，8 nmol 12 bp接头，16°C孵育过夜。经琼脂糖电泳检测，无明显未连接接头。

Fast Pace Ligation Buffer：

1.16小时孵育检测：50μL反应体系中包含1×Fast Pace Ligation Buffer和1μg HindIII-λDNA，37°C下孵育16小时。经琼脂糖凝胶电泳检测，条带无降解；50μL反应体系中包含1×Fast Pace Ligation Buffer和1μg T3 DNA，37°C下孵育16小时。经琼脂糖凝胶电泳检测，条带无降解。

2.核酸内切酶活性：50μL反应体系中包含1×Fast Pace Ligation Buffer和1μgφX174 RF I DNA，37°C下孵育4小时。经琼脂糖凝胶电泳检测，RF II转化比率<10%。

3.RNase活性：在1×Fast Pace Ligation Buffer中加入40 ng FAM-RNA，37°C下孵育16小时。经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，条带无降解。

4.磷酸酶活性检测：在磷酸酶活性检测缓冲液中加入1×Fast Pace Ligation Buffer和2.5 mM对硝基苯磷酸，37°C下孵育4小时。经光谱测定法检测，405 nm处无对硝基苯阴离子特征吸收峰。

应用^[7][8]

快速DNA连接模块可用于快速构建DNA文库：

随着基因检测,免疫试纸条等检测工具的广泛应用,酶介导的生物化学检测越来越受到人们的重视。然而随着人类生活水平的不断提高,传统工具酶已经无法满足人们的需求。蛋白质的定向进化,是在短时间内改变酶的结构和性质最主要的手段,通过不断的体外进化,可以得到对环境耐受性较强,催化活性较高的进化酶。蛋白质的定向进化技术现已成功应用于上百种酶的进化,在生产生活领域产生了巨大影响。

蛋白质的定向进化主要有两种手段,一类是以易错PCR为代表的,基于基因突变原理构建突变体文库。这种方法所构建的突变体文库多样性较高,但有效性较低,且无法应用于同源性低的DNA片段;另一类是以DNA shuffling为代表的,基于基因重组原理构建组合文库。该方法不仅可以将同源性较低的DNA片段随机组合,而且可以将不同生物体的非同源基因进行重组,极大的丰富了DNA重组范围,有效性较高,但多样性较低。

针对现有构建组合文库方法的缺点,以卡那霉素抗性蛋白为研究对象,设计了一种多模块组装构建组合文库的新方法。该方法从天然存在的蛋白质中提取二级结构元件为模块,在模块两端设计可被Hinf I限制性核酸内切酶消化的Linker,随后将消化的DNA模块以有义方向随机连接,并通过PCR对重组的目的片段进行扩增。然后通过与实验室自制的SV载体的连接、转化和筛选,构建组合文库。

通过筛选,实验得到了10~5个阳性克隆。通过对500个克隆的电泳分析,可知插入的重组DNA片段大小不一,具有较好的多样性;通过对20个克隆的测序的比对分析,可知其与野生型蛋白完全不同,且各模块均为正向连接,说明该文库多样性好,有效性高;通过对插入片段长度的统计分析,不同插入片段模块组成的分析,不同二级结构模块连接概率分析和模块长度与连接概率的关联分析,充分说明了所构建的组合文库各模块连接的随机性。

开发出了一种全新的能够实现模块随机组装的文库构建新方法,通过简单地操作流程,DNA模块可以完全随机组装成DNA片段。从理论上说,该方法可以构建一个M^N(M:模块的组装数量,N:模块数)的庞大组合文库。由于本实验DNA模块是随机组装的,所以该方法有助于研究蛋白的结构与功能之间的关系,此外,构建的随机组合文库为计算机模拟高通量蛋白质筛选以及合成生物学提供了方法借鉴。

参考文献

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[2]Strategies for the discovery and engineering of enzymes for biocatalysis[J].Timo Davids,Marlen Schmidt,Dominique B?ttcher,Uwe T Bornscheuer.Current Opinion in Chemical Biology.2013(2)

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[4]Identification of conditionally essential genes for growth of Pseudomonas putida KT2440 on minimal medium through the screening of a genome‐wide mutant library[J].M.AntoniaMolina‐Henares,JesúsDe La Torre,AdelaGarcía‐Salamanca,A.JesúsMolina‐Henares,M.CarmenHerrera,EstrellaDuque.Environmental Microbiology.2010(6)

[5]Evolution in Reverse:Engineering a D‐Xylose‐Specific Xylose Reductase[J].Nikhil U.Nair,HuiminZhao.ChemBioChem.2008(8)

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