cfDNA 清理磁珠

背景^[1-6]

cfDNA Clean Beads是基于一种固相载体可逆化固定（SPRI）的分离纯化方法。磁珠体系中一般包含：磁珠、DNA、聚乙二醇（PEG）、以及盐离子等，在一定浓度的PEG和盐离子环境中，DNA可吸附到羧基修饰的高分子磁珠表面（即固相载体），该过程是可逆的，在适当条件下，结合的DNA分子可以被洗脱回收。

纳米级别的磁珠表面性质不同，分离原理也不尽相同，但基本上固态的球状材料组成并无太大差异，基础结构一般分为3层，最内层的核心是聚苯乙烯、第二层包裹磁性物质——四氧化三铁（Fe3O4），最外层表面是羧基（-COOH）修饰的高分子材料所构成，其中羧基行使与核酸结合的工作。在整个体系中，PEG是影响DNA回收的决定性因素（其他因素还包括DNA大小和浓度、盐离子浓度、孵育时间等等）。DNA在一定浓度的PEG存在条件下，NaCl或MgCl2促进条件下，使DNA发生脱水反应，分子构象会发生急剧变化，由线状被压缩形成卷曲球状，继而聚集沉淀，同时随PEG分子量、浓度以及盐浓度的不同，不同长度的DNA可以被选择性的沉淀出来。

在磁珠体系中，特定分子量的PEG的功能主要是与盐离子共同作用，改变不同长度DNA的分子构象，同时增加体系的粘稠程度，使磁珠存在其中处于悬浮状态，不易沉降，增加磁珠在空间位置的碰撞与排斥，从而增加核酸与磁珠的聚集效率与效果，除此之外，PEG与蛋白质具有相容性，也可去除样品中的蛋白质。cfDNA提取过程中，常会引入大片段DNA或gDNA的污染。常规情况下，这些污染物可以通过对目的片段进行磁珠分选回收而去除。但是，由于cfDNA仅有170 bp左右，常用的AMPure XP或SPRI Select磁珠对100-200 bp的回收效率较低，无法获得理想的cfDNA回收效果。

Hieff NGSTM cfDNA Clean Beads(100-200 bp)是针对上述问题的解决而专门设计的磁珠类产品，其基于SPRI(Solid Phase Reverse Immobilization)原理制备，配合精心优化的缓冲体系和已经验证的操作体系，可精确回收100-200 bp cfDNA，有效去除大片段DNA和gDNA的污染，同时具有操作简单、回收率高（>95%）等优势。使用本品获得的cfDNA产物，可直接应用二代测序文库构建、克隆、酶切、连接等反应。本产品中提供的所有试剂组分均经过严格质检，zui高程度保障产品优异性能与批间稳定性。

注意事项：

1）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

2）磁珠使用前须在室温平衡至少30 min。

3）80%乙醇需现用现配，否则将影响回收效率。

4）进行长度分选时，初始样品体积需≥50μL，不足时请用超纯水补齐。样品体积太小，将导致移液误差增大，进而影响分选的准确性。

使用方法：

1.准备工作

将磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2.长度分选（双轮法）

1）请涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证混匀。

2）根据要求，参考表1向DNA溶液中加入轮分选磁珠，涡旋混匀或移液器吹打10次混匀。

3）室温孵育5 min。

4）将离心管短暂离心并置于磁力架中，待溶液澄清后（约5 min），小心转移上清到干净的离心管中。【注意：转移上清时，请勿吸取磁珠，即使微量残留都将影响后续文库质量。】

5）向上清中加入第二轮分选磁珠。

6）涡旋混匀或移液器吹打10次混匀，室温静置5 min。

7）将离心管短暂离心并置于磁力架中，待溶液澄清后（约5 min），小心移除上清。

8）保持EP管始终处于磁力架中，加入200μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec，小心移除上清。

9）重复步骤8。

10）保持离心管始终处于磁力架中，开盖干燥磁珠至刚刚出现龟裂（约5 min）。

11）将离心管从磁力架中取出，加入适量ddH2O（≥20μL），涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀，室温静置5 min。

12）将离心管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清后（约5 min），小心吸取上清至干净的管中，即完成纯化。

应用^[7][8]

cfDNA 清理磁珠可用于cfDNA提取实验的纯化：

新一代分析技术总的发展方向是更加微型化、自动化、快速化和集成化,而近几年出现的微流控分析(Microfluidic analysis)正是为实现这一目标服务的主要领域之一。微流控分析在其发展过程中结合了越来越多的技术,而这些技术又推动了微流控分析领域的不断发展。比如磁场和磁性粒子与微流控系统的结合,虽然时间并不长,但已在分离分选、控制、捕获、传输和混合上得到很多应用,遍及生物、医药、化学、物理、药物等各个领域。

在微流控芯片上使用磁珠提取DNA已经有了很多的报道,集成化程度也很高,但是芯片系统加工比较繁琐。本工作的主要内容是建立基于毛细管的微流控磁珠DNA提取系统。章介绍了在微流控领域利用磁性物质和磁场进行微流控操作的进展领域结合产生的功能及其主要运用。第二章中介绍了基于毛细管的微流控磁珠DNA提取系统。系统基于毛细管构建,结构简单,不需采用昂贵的微加工设备和复杂的微加工技术。系统采用重力驱动液流,操作方便。系统被应用于全血中DNA的提取。

参考文献

[1]Application of Superhydrophobic Surface with High Adhesive Force in No Lost Transport of Superparamagnetic Microdroplet.X.Hong,X.F.Gao,L.Jiang.Journal of the American Chemical Society.2007

[2]Magnetic levitation of microdroplets in air.V.Haguet,C.Jeandey,H.Chetouani,G.Reyne,F.Chatelain.μTAS 2006.

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[5]A microfabricated bio-magnetic separator based Micro Total Analysis Systems.N.Chronis,W.Lam,L.Lee..2001

[6]Self-Assembly of Colloidal Pyramids in Magnetic Fields.L.E.Helseth.Langmuir.2005

[7]Colloidal Rings in a Liquid Mixture.L.E.Helseth,RM.Muruganathan,Y.Zhang,T.M.Fischer.Langmuir.2005

[8]沈玉勤. 基于毛细管的磁珠微流控DNA富集提取系统的研究[D].浙江大学,2007.