MaxUp mRNA建库试剂盒

背景^[1-6]

MaxUp mRNA建库试剂盒是针对Illumina高通量测序平台专门研发的用于mRNA转录组文库构建试剂盒MaxUp mRNA建库试剂盒cDNA二链合成模块配有两种buffer，可根据需要进行常规建库或链特异性建库。本产品适用于起始模板为10 ng-1μg不同来源真核生物总RNA样本。经过mRNA分离、片段化、链双链cDNA合成、末端修复、加A尾、接头连接和文库扩增，总RNA样品zui终转化为适用于Illumina平台测序的文库。

试剂盒包含三个独立模块，BOX-I的核心为纯化mRNA所需的poly（A）磁珠。BOX-II包含mRNA片段化试剂，反转录试剂，常规和链特异性dscDNA合成所需的所有试剂。其中链特异性二链合成buffer中将dTTP替换为dUTP，使cDNA第二链中掺入dUTP，而本试剂盒使用的高保真DNA聚合酶无法扩增含尿嘧啶的DNA模板，实现链特异性。

提供的所有试剂都经过严格的质量控制和功能验证，zui大程度上保证了文库构建的稳定性和重复性。MaxUp mRNA建库试剂盒适用于起始模板量为10-1000 ng（体积≤50μL）的高质量动物、植物和真菌等真核生物的总RNA。如初始RNA浓度偏低，体积超过50μL，可使用Hieff NGSTM RNA Cleaner磁珠进行浓缩。RNA需通过Agilent 2100 Boanalyzer RNA 6000 Nano/Pico芯片检测，RIN值要求＞7，以保证mRNA有完整的poly(A)尾结构。

MaxUp mRNA建库试剂盒的mRNA分离模块使用的是oligo d(T)磁珠，只有带poly(A)尾的mRNA才能被提取；其他不具poly(A)尾的mRNA，如非编码RNA、无poly(A)尾的mRNA等不能适用本试剂盒。此外，FFPE样本中的mRNA降解严重，通常无完整的poly(A)尾结构，故亦无法使用本试剂盒进行建库。

文库质检（Library Quality Analysis）

1.通常情况下，构建好的文库可通过长度分布检测和浓度检测来进行质量评价。

2.文库浓度检测可使用：基于双链DNA荧光染料的方法，如Qubit、PicoGreen等；基于qPCR定量的方法。

3.推荐使用qPCR方法进行文库浓度检测：Qubit等基于双链DNA荧光染料的浓度测定方法时，无法有效区分单端连接Adapter的产物、两端均未连接Adapter的产物及其他不完整双链结构产物；qPCR定量基于PCR扩增原理，仅定量样品中两端Adapter完整的文库（即可测序的文库），可排除单端或双端都不连接Adapter的不可测序文库的干扰。

4.文库浓度检测不可使用：基于光谱检测的方法，如NanoDrop等。

5.文库长度分布检测，可通过Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛细管电泳或微控流原理的设备进行检测。

应用^[7][8]

MaxUp mRNA建库试剂盒所制备文库可进行多种RNA-Seq应用，包括：

基因表达（gene expression）

单核苷酸变异检测（single nucleotide variation discovery）

基因融合鉴定（gene fusion identification）

剪切变异体分析（splice variant analysis）

通过新一代测序技术(Next generation sequencing,NGS),对垂体ACTH腺瘤全转录组进行高通量测序,在转录组水平筛选相关差异表达基因和microRNA;并与患者临床表型进行关联分析,探究垂体ACTH腺瘤所致临床表型的分子机理,此外,考虑到血清游离miRNA具有作为肿瘤标志物的潜力,筛选差异表达的血清miRNA,并对差异表达的血清miRNA进行了验证,为深入研究库欣病的发病机制,筛选诊断标志物提供依据。

以期最终实现垂体腺瘤患者个性化治疗。垂体腺瘤是常见的颅内良性肿瘤之一,发病率居颅内肿瘤第二位,约占颅内肿瘤的10%-15%,并呈现逐年增加的趋势。随着肿瘤不断生长,可压迫蝶鞍区周围结构,如视神经、海绵窦、脑底动脉、下丘脑等,甚至累及额叶、脑干,而导致严重的功能障碍。同时,肿瘤生长还可导致垂体激素分泌紊乱。

按照外周血激素水平,垂体腺瘤分为无功能型垂体腺瘤(NFPA)和功能型垂体腺瘤,包括：泌乳素腺瘤(PRL)、促肾上腺皮质激素腺瘤(Cushing)、生长激素腺瘤(GH)、促甲状腺激素腺瘤(TSH)、促性腺激素腺瘤(PGA)以及混合激素分泌腺瘤等。其中垂体促肾上腺皮质激素腺瘤(ACTH-PAs)临床又称为库欣病(Cushing’s Disease)是一种伴有促肾上腺皮质激素(ACTH)分泌的功能型垂体腺瘤约占全部垂体腺瘤的14%,约占库欣综合征(Cushing’s syndrome)的70%。

参考文献

[1]Expression pattern of the Hedgehog signaling pathway in pituitary adenomas[J].Maria P.Yavropoulou,Anna Maladaki,Konstantina Topouridou,Vasiliki Kotoula,Chris Poulios,Emily Daskalaki,Nikolaos Foroglou,George Karkavelas,John G.Yovos.Neuroscience Letters.2015

[2]Identification and characterization of tumor suppressor and oncogenicmiRNAs in gastric cancer[J].Zhaofeng Chen,Xiaoguang Liu,Zenan Hu,Yuping Wang,Min Liu,Xiaojun Liu,Hailong Li,Rui Ji,Qinhong Guo,Yongning Zhou.Oncology Letters.2015(1)

[3]Downregulation of Insulin-like growth factor binding protein 6 is associated with ACTH-secreting pituitary adenoma growth[J].Yakun Yang,Miaomiao Sheng,Fengming Huang,Dechao Bu,Xiaohai Liu,Yong Yao,Congxin Dai,Bowen Sun,Jindong Zhu,Yonghui Jiao,Zhenqing Wei,Huijuan Zhu,Lin Lu,Yi Zhao,Chengyu Jiang,Renzhi Wang.Pituitary.2014(6)

[4]Acromegaly:An Endocrine Society Clinical Practice Guideline[J].Laurence Katznelson,Edward R.Laws,Shlomo Melmed,Mark E.Molitch,Mohammad Hassan Murad,Andrea Utz,John A.H.Wass.The Journal of Clinical Endocrinology&Metabolism.2014(11)

[5]MicroRNA expression profile of bromocriptine-resistant prolactinomas[J].Zhe Bao Wu,Wei Qiang Li,Shao Jian Lin,Cheng De Wang,Lin Cai,Jiang Long Lu,Yun Xiang Chen,Zhi Peng Su,Han Bing Shang,Wen Lei Yang,Wei Guo Zhao.Molecular and Cellular Endocrinology.2014(1-2)

[6]Detection of recurrent Cushing’s disease:proposal for standardized patient monitoring following transsphenoidal surgery[J].Alejandro Ayala,Alex J.Manzano.Journal of Neuro-Oncology.2014(2)

[7]MicroRNAs as Biomarkers in Pituitary Tumors[J].Antonio Di Ieva,Henriett Butz,Marzia Niamah,Fabio Rotondo,Salvatore De Rosa,Aydin Sav,George M.Yousef,Kalman Kovacs,Michael D.Cusimano.Neurosurgery.2014(2)

[8]孙博文.基于全转录组深度测序的垂体ACTH腺瘤mRNA及microRNA表达谱分析[D].北京协和医学院,2016.