全能型DNA建库试剂盒

背景^[1-6]

全能型DNA建库试剂盒是针对Illumina®高通量测序平台定向优化而成的新一代建库试剂盒。全能型DNA建库试剂盒采用高质量的酶学组成，简化的操作流程，可显著提高低质量样本文库转化率与扩增效率，具有广泛的样本适应性，同时兼容FFPE、cfDNA、ChIP DNA等样本，助力获得优异的测序数据。全能型DNA建库试剂盒建库方法运用高活性的转座酶，完成DNA的片段化和加接头，具有快速、操作简单和低建库起始量的优点，缺点是插入序列具有偏好性，对DNA的纯度和DNA浓度准确性要求较高。

全能型DNA建库试剂盒采用转座酶随机插入并将基因组DNA打断成长度大小为300bp左右的片段，同时将测序所需的adaptor直接在插入打断的同时连接到片段的两端，缩短了建库时间、减少了样品的需求量，因此特别适合样品量有限的应用，如肿瘤活检、降解的DNA或纯化的DNA。

技术流程:（1）DNA待测文库构建

利用超声波把待测的DNA样本打断成小片段，目前除了组装之外和一些其他的特殊要求之外，主要是打断成200-500bp长的序列片段，并在这些小片段的两端添加上不同的接头，构建出单链DNA文库。

（2）Flowcell

Flowcell是用于吸附流动DNA片段的槽道，当文库建好后，这些文库中的DNA在通过flowcell的时候会随机附着在flowcell表面的channel上。每个Flowcell有8个channel，每个channel的表面都附有很多接头，这些接头能和建库过程中加在DNA片段两端的接头相互配对（这就是为什么flowcell能吸附建库后的DNA的原因），并能支持DNA在其表面进行桥式PCR的扩增。

（3）桥式PCR扩增与变性

桥式PCR以Flowcell表面所固定的接头为模板，进行桥形扩增。经过不断的扩增和变性循环，最终每个DNA片段都将在各自的位置上集中成束，每一个束都含有单个DNA模板的很多分拷贝，进行这一过程的目的在于实现将碱基的信号强度放大，以达到测序所需的信号要求。

（4）测序

测序方法采用边合成边测序的方法。向反应体系中同时添加DNA聚合酶、接头引物和带有碱基特异荧光标记的4中dNTP（如同Sanger测序法）。这些dNTP的3’-OH被化学方法所保护，因而每次只能添加一个dNTP。在dNTP被添加到合成链上后，所有未使用的游离dNTP和DNA聚合酶会被洗脱掉。接着，再加入激发荧光所需的缓冲液，用激光激发荧光信号，并有光学设备完成荧光信号的记录，最后利用计算机分析将光学信号转化为测序碱基。

这样荧光信号记录完成后，再加入化学试剂淬灭荧光信号并去除dNTP 3’-OH保护基团，以便能进行下一轮的测序反应。Illumina的这种测序技术每次只添加一个dNTP的特点能够很好的地解决同聚物长度的准确测量问题，它的主要测序错误来源是碱基的替换，目前它的测序错误率在1%-1.5%之间，测序周期以人类基因组重测序为例，30x测序深度大约为1周。

操作注意：

1.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

2.请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀，短暂离心后置于冰上待用。

3.配制各步骤反应液时推荐使用移液器吹打混匀或轻轻振荡，剧烈振荡可能会造成文库产出下降。

4.为避免样品交叉污染，推荐使用带滤芯的枪头，吸取不同样品时请更换枪头。

5.推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应，使用前应预热PCR仪至反应温度附近。

6.PCR产物因操作不当极容易产生气溶胶污染，进而影响实验结果准确性。推荐将PCR反应体系配制区和PCR产物纯化检测区进行强制性的物理隔离；使用专用的移液器等设备；并定时对各实验区域进行清洁（使用0.5%次氯酸钠或10%漂白剂进行擦拭清理），以保证实验环境的洁净度。

应用^[7][8]

全能型DNA建库试剂盒可用于二代测序DNA文库构建：

近两年来,随着二代测序技术的不断发展完善,ctDNA检测的敏感性及特异性有了显著提升,这也给ctDNA的早期肿瘤诊断提供了更多的可能。循环游离DNA(Circulating free DNA,cfDNA)的检测逐渐成为肿瘤领域新的热点和趋势,其中来源于肿瘤组织或细胞的DNA称为循环肿瘤DNA(Circulating tumor DNA,ctDNA)。

但目前大多数cfDNA的研究均集中于晚期肿瘤的治疗评估、耐药复发及疗效监测。早期肿瘤患者由于其肿瘤负荷低,因而cfDNA丰度及ctDNA比例均明显低于晚期肿瘤患者,不易进行检测与评估。基于二代测序技术的cfDNA拷贝数变异(Copy Number Variations,CNVs)检测在晚期肿瘤中研究较多,但早期肿瘤领域鲜有人涉足。着眼于早期肺癌cfDNA的CNVs检测,通过肺癌患者与肺部炎症患者组织标本及血浆cfDNA的CNVs对比,尝试提出肿瘤早期诊断的另一途径。

参考文献

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