微生物氮循环相关基因PCR芯片检测

背景^[1-6]

微生物氮循环相关基因PCR芯片检测通过PCR技术可检测微生物参与氮循环相关的基因。氮是所有生物的重要组成部分，也是各种生命体的主要营养成分。氮的利用需要借助微生物进行转化，参与氮循环的微生物主要通过氨化作用、硝化作用、反硝化作用、固氮作用等将N2、无机氮化合物、有机氮化合物在自然界中相互转化。

氨来源于腐生生物对死亡动植物器官的分解，被用作制造铵离子(NH4+)。在富含氧气的土壤中，这些离子将会首先被亚硝化细菌转化为亚硝酸根离子(NO2-)，然后被硝化细菌转化为硝酸根离子(NO3-)。铵的两步转化过程被叫做硝化作用。

铵离子很容易被固定在土壤尤其是腐殖质和粘土中。而硝酸根离子和亚硝酸根离子则因它们自身的负电性而更不容易被固定在正离子的交换点（主要是腐殖质）多于负离子的土壤中。在雨后或灌溉后，流失（可溶性离子譬如硝酸根和亚硝酸根的移动)到地下水的情况经常会发生。地下水中硝酸盐含量的提高关系到饮用水的安全，因为水中过量的硝酸根离子会影响婴幼儿血液中的氧浓度并导致高铁血红蛋白症或蓝婴综合征(Blue-baby Syndrome)。

如果地下水流向溪川，富硝酸盐的地下水会导致地面水体的富营养作用，使得蓝藻菌和其它藻类大量繁殖，导致水生生物因缺氧而大量死亡。虽然不像铵一样对鱼类有毒，硝酸盐可通过富营养作用间接影响鱼类的生存。氮素已经导致了一些水体的富营养化问题。从2006年起，在英国和美国使用氮肥将受到更严厉的限制，磷肥的使用也将受到了同样的限制。在无氧（低氧）条件下，厌氧细菌的“反硝化作用”将会发生。

最终将硝酸中氮的成分还原成氮气归还到大气中去。氮循环是全球生物地球化学循环的重要组成部分，全球每年通过人类活动新增的“活性”氮导致全球氮循环严重失衡，并引起水体的富营养化、水体酸化、温室气体排放等一系列环境问题。

应用^[7][8]

微生物氮循环相关基因PCR芯片检测可用于环境微生物群落与功能基因中的应用研究：

运用分子生态学中的功能基因芯片(functional gene arrays, FGAs)和限制片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)技术对环境微生物群落和功能基因进行了研究。(1)采用对土壤施加氮肥的方式模拟氮沉积对植物和微生物的影响。从美国明尼苏达大学的Cedar Creek生态科学研究保留地BioCON试验田取得24个样品,12个样品经过施加氮肥的处理,12个样品没有施加氮肥。

通过对24个样品的基因组DNA提取和功能基因芯片技术分析后,发现氮肥的施用对土壤中微生物群落结构和植物生长产生了显著的影响。施加氮肥使得采样点的植物地上部分的生物量增加,同时使得植物的地下根部的生物量减少；施加氮肥后,还使得土壤中微生物群落多样性下降。(2)从百分比上来看,参与碳循环、氮循环、硫循环、磷循环、抗生素、金属抗性、能量代谢和有机物修复的八大类功能基因在施加氮肥和未施加氮肥的样品中百分比相似,没有显著的差异性。从数量上看,八大类功能基因的数量在施加氮肥的样品中比未施加氮肥的样品少。

对参与碳循环、氮循环、硫循环和磷循环的功能基因分析后发现,在施加氮肥的样品中参与碳循环、氮循环、硫循环和磷循环的大部分功能基因丰度下降,而且这种差异很显著；同时还对参与氮循环作用的关键功能基因进行了详细地分析。(3)研究了13个外界因子与24个样品中微生物群落结构之间的关系,发现其中七个外界因子在改变样品的微生物群落结构中可能起到了关键作用。这七个外界因素为：土壤中氮含量(%),土壤C/N比,地上C/N比,土壤中氮含量(g/m2),地上氮含量(g/m2),pH值,和湿度(0-20cm)。

对13个外界因子和24个样品的功能基因芯片数据进行了VPA分析,结果表明："Environmentalfactors"部分能够独立解释样品之间44.37%的差异；"Plant biomass"部分能够独立解释样品之间8.21%的差异；"Environmental factors"和"Plant biomass"的重叠部分能够解释样品之间0.05%的差异；由于土壤样品的复杂性,样品之间的差异还有47.37%不能被解释。

参考文献

[1]Microbial communities in acid water environments of two mines, China[J] . Shengmu Xiao,Xuehui Xie,Jianshe Liu.  Environmental Pollution . 2008 (3)

[2]Bacterial and fungal response to nitrogen fertilization in three coniferous forest soils[J] .   Soil Biology and Biochemistry . 2007 (2)

[3]Gross nitrogen mineralisation and fungi-to-bacteria ratios are negatively correlated in boreal forests[J] .   Biology and Fertility of Soils . 2007 (2)

[4]The effects of resource enrichment, dispersal, and predation on local and metacommunity structure[J] . Marc W. Cadotte,Allison M. Fortner,Tadashi Fukami.  Oecologia . 2006 (1)

[5]Determination of microbial diversity in environmental samples: pitfalls of PCR‐based rRNA analysis[J] . Friedrich V. Wintzingerode,Ulf B G?bel,Erko Stackebrandt.  FEMS Microbiology Reviews . 2006 (3)

[6]Cytochromes c of Acidithiobacillus ferrooxidans[J] . Andrés Yarzábal,Ga?l Brasseur,Violaine Bonnefoy.  FEMS Microbiology Letters . 2006 (2)

[7]Divergent effects of elevated CO 2 , N fertilization, and plant diversity on soil C and N dynamics in a grassland field experiment[J] . Feike A. Dijkstra,Sarah E. Hobbie,Peter B. Reich,Johannes M. H. Knops.  Plant and Soil . 2005 (1)

[8]分子生态学技术在环境微生物群落与功能基因中的应用研究[D]. 肖升木.东华大学 2010