凋亡PCR芯片检测

背景^[1-6]

凋亡PCR芯片检测运用高通量荧光定量PCR方法，在一张96孔或384孔板上同时对某个信号通路或疾病相关基因的表达量变化进行检测，芯片上的基因包括了与研究对象有确定关系的基因或者待考证的基因。细胞凋亡ARRAY含有84个与人细胞凋亡相关的基因，包括促凋亡基因，抗凋亡基因，细胞损伤基因，凋亡调节基因等。

实时定量PCR是检测基因表达最灵敏、最可靠的方法，但只能检测少数几个基因的表达水平。若要检测大量基因，则工作量巨大，耗时长久。PCR芯片，克服了这一缺点，可同时进行多种基因检测，还可以节省数据分析时间，使研究者可以在更短的时间内得到更丰富的信息。

PCR芯片可广泛用于生命科学、生物技术、疾病检测、临床医学和环境检测等领域，是近年生命科学领域常用的研究手段之一。随着研究的的段进展，需要研究的基因也在不断地更新换代，找到一张适合自己的PCR芯片，也就成为了实验成功的关键。

生物体内环境的稳定，不但依赖细胞增殖和分化，也依赖于细胞的凋亡。细胞凋亡（apoptosis）又称编程性死亡，是生物界重要的生命现象之一。从线虫至高等哺乳类动物，从胚胎至成人，从生理到病理，从生到死整个过程，体内不同的细胞多具有此种死亡形式。早在100多年前Carl Vogt已发现这种死亡形式。1972年Kerr等人重新提出研究，并命名为凋亡（apoptosis）。

其后在凋亡的形态学和生物化学等领域取得新的认识。细胞凋亡PCR芯片有96孔和384孔两种规格，可以同时对几十到几百个与某一主题相关的基因进行分析。产品采用SYBR Green实时荧光PCR方法。以96孔PCR芯片为例，基因专一性引物已分别固定在96孔PCR芯片中。只需要将反转录反应产生的cDNA与PCR master mix混合，再将混合物分配到PCR板的96个孔位，进行实时荧光PCR反应，就能轻松获得91个相关基因的表达情况。

应用2块96孔PCR芯片分别对实验样品和对照样品进行分析，就能对91个基因的表达进行相对定量。每一块96孔PCR芯片设有4个看家基因对照（β-actin,GAPDH,18S,28S），以方便在实验下选择稳定表达的参比基因，用于基因表达相对定量。每块PCR芯片还设有一个PCR阳性对照（Positive Control）。PCR阳性对照用于质控PCR反应。

应用^[7][8]

凋亡PCR芯片检测可用于检测凋亡信号通路的相关基因表达：

结直肠癌(colorectal carcinoma,CRC)是我国前三位最常见的恶性肿瘤,同时也是导致肿瘤患者死亡的主要原因之一,近年来发病率呈逐年上升趋势。虽然在结直肠癌发病初期,90%的病人可手术治疗治愈,可是大部分病人在确诊时已是癌症晚期,预后极差。CRIP1是LIM家族成员,蛋白分子量8kDa,属于小分子量蛋白,已经有研究结果表明,CRIP1在乳腺癌、子宫内膜癌、前列腺癌及胰腺癌中高表达,并对疾病的预后有重要影响,而在结直肠癌中的表达及功能还不甚清楚,本课题立意研究CRIP1对结直肠癌发生发展的影响及调控机制,争取为结直肠癌的有效治疗找到新的靶点或途径。

方法1.分析CRIP1在结直肠癌中的表达情况,通过实时定量PCR法检测CRIP1在结直肠癌细胞中的mRNA水平,免疫印迹检测其蛋白表达水平,以及免疫组化探索在结直肠癌组织及癌周组织的表达情况;2.构建CRIP1过表达载体,通过瞬时转染后CCK8及EDU增殖实验研究过表达CRIP1后对SW620细胞增殖能力的影响,采用流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡情况,并同时采用Tunel细胞成像实验检测细胞的凋亡。

另采用5-氟尿嘧啶(5-FU)处理细胞,观察CRIP1过表达对药物诱导细胞凋亡的影响;3.构建CRIP1干扰片段,采用上述相同研究方案进行验证;4.免疫印迹探究CRIP1对凋亡相关蛋白的调控情况,特别是对结直肠癌细胞Fas和FasL的表达调控关系,其中FasL的检测采用酶联免疫吸附(ELISA)测定,后利用流式细胞仪及细胞成像法进行恢复试验验证CRIP1在Fas/FasL通路调控中的关键作用;5.探究CRIP1对Fas的调控机制,使用荧光定量RT-PCR及免疫印迹探究CRIP1对Fas在mRNA水平及蛋白水平的影响,然后通过免疫共沉淀实验(CO-IP)对CRIP1及Fas之间相互作用及泛素化调控机制进行探究。

参考文献

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