细菌素PCR芯片

背景^[1-6]

细菌素PCR芯片是通过高通量PCR技术检测细菌素相关基因。细菌素通过消除或控制腐败微生物和病原体来保存食品，被认为是安全的食品防腐剂，它们由多种细菌产生，包括多种乳酸菌。

通过PCR技术可快速鉴定乳酸菌产生的细菌素基因。细菌素是某些细菌在代谢过程中通过核糖体合成机制产生的一类具有抑菌活性的多肽或前体多肽。对同种近缘菌株呈现狭窄的抑制谱，通过在靶细胞上穿孔、抑制肽聚糖合成，与核糖体或tRNA相互作用抑制蛋白质合成，直接降解靶细胞DNA，从而起到抑菌效果。

细菌素是细菌用于调控菌群结构的一种有力武器。细菌素作为细菌生活中的一种竞争利器，既有利于细菌素生产菌侵入一个原本稳定的微生物区系，也可以作为细菌素生产菌的一种防御武器，防止自身建立的稳定区系受到其他细菌的侵犯。研究结果表明，在接种量不足的情况下，产细菌素的细菌通常很难侵入生活在液体培养这样生长有序的敏感菌群，这是因为少量的细菌素在高度稀释后无法将敏感菌杀死，而细菌素合成的适合度代价却使细菌素生产菌处于明显的竞争劣势。

相反，如果向液体培养中的细菌素生产菌群中接入少量的敏感菌，因为细菌素的存在，敏感菌根本不可能得到存活。然而，在固体培养这种结构化的环境中，因为不同的空间结构中所含营养成分的不一致，细菌素生产菌则可以占据营养竞争相对较弱的地方，而敏感菌则可生活在养分竞争较为激烈的区域，从而达到两者相安无事。

在更为复杂的天然生境中（如动物肠道等），细菌素的分泌给整个细菌群落带来的影响主要是取决于细菌素生产菌分泌细菌素所付出的代价，从理论上来说，细菌素生产菌、敏感菌与周围其他共栖菌群是完全可以达到一种动态的平衡。

分泌细菌素的肠道菌更有利于其在肠道中的成功定植，利用分泌细菌素的细菌制成益生素来维持或恢复动物肠道菌群的稳定性也得到越来越多的应用。大量实验室纯培养的研究结果也表明，细菌素的分泌一般都是在菌体增殖到一定数量后，即对数生长后期才开始分泌并一直延续到平台期。在这个时期，环境中的细菌数量急速增加，生存空间和营养素开始出现不足，细菌素生产菌在群体效应等不同机制的介导下就会启动细菌素的分泌，企图通过细菌素的分泌来杀灭同一生活环境中的敏感菌株，从而获得更多的养料与生存空间来维持自身的生存。此外，还可以通过分泌细菌素将敏感菌菌体裂解来获取养料。

应用^[7][8]

细菌素PCR芯片可用于高表达生物素乳酸菌的筛选及鉴定：

乳酸菌是一种在食品发酵工业中广泛应用的益生菌。它可以抑制或杀死一些病原菌和食物腐败菌，有利于人的健康。近几年的研究表明有些乳酸菌均能分泌产生一种或多种抑菌物质，其中由核糖体合成的一类称为细菌素的具有抑菌活性的多肽或前体多肽，因其具有高效、无毒、无残留、无抗药性等优点已成为生物食品防腐研究的重点，同时被认为是抗生素最有效的替代物。自乳酸乳球菌产生的细菌素nisin获准作为安全性高的食品防腐剂以来，细菌素的研究已成为微生物学研究中一个活跃的领域。

研究内容主要涉及产细菌素菌株的筛选和鉴定、细菌素的分离纯化、理化性质、作用机制、发酵条件和应用以及工程菌株的构建等。近年来关于细菌素的研究虽在分子水平和应用研究上取得很大进展，但分离纯化效率仍不甚理想。因此，本实验旨在筛选出一种产广谱细菌素的乳酸菌，着重研究该细菌素的分离纯化方法，进而对其进行鉴定和特性分析。采用双层琼脂牛津杯法，以藤黄微球菌为指示菌，对13种菌株(经本实验室筛选保存)进行筛选。同时分别排除了三个干扰因素——酸性末端产物、过氧化氢以及离心上清液菌体残留细胞；并采用蛋白酶作最后的产细菌素鉴定。

实验结果显示，有五种乳酸菌产细菌素，其中8号从婴儿粪便中筛选分离得到的菌株稳定性，抑菌活性最强。经PCR分子鉴定和理化性质的研究得出该菌株为植物乳杆菌L.plantarum DSM20205；理化性质基本符合乳杆菌的特征，淀粉水解、油脂水解、明胶水解和尿素试验、吲哚试验、M．R试验、V．P试验、硫化氢试验反应均呈阴性，糖发酵试验则大多数呈阳性反应。据所查文献涉及的范围，目前为止该细菌素的发现应属首例，国内外还没有分离纯化过该植物乳杆菌L．plantarum DSM20205分泌产生的细菌素。

参考文献

[1]Bacteriocins:Biological tools for bio-preservation and shelf-life extension[J].Lucy H.Deegan,Paul D.Cotter,Colin Hill,Paul Ross.International Dairy Journal.2006(9)

[2]Cloning and Production of a Novel Bacteriocin,Lactococcin K,from Lactococcus lactis Subsp.lactis MY23[J].Yun Seog Kim,Min Ju Kim,Pil Kim,Jung Hoe Kim.Biotechnology Letters.2006(5)

[3]Variations in the energy metabolism of biotechnologically relevant heterofermentative lactic acid bacteria during growth on sugars and organic acids[J].T.Zaunmüller,M.Eichert,H.Richter,G.Unden.Applied Microbiology and Biotechnology.2006(3)

[4]Inhibition of Listeria innocua and Brochothrix thermosphacta in vacuum‐packaged meat by addition of bacteriocinogenic Lactobacillus curvatus CRL705 and its bacteriocins[J].P.Castellano,G.Vignolo.Letters in Applied Microbiology.2006(2)

[5]Nisin Biosynthesis and its Properties[J].Chan-Ick Cheigh,Yu-Ryang Pyun.Biotechnology Letters.2005(21)

[6]Mode of action of modified and unmodified bacteriocins from Gram-positive bacteria[J].Yann Héchard,Hans-Georg Sahl.Biochimie.2002(5)

[7]Potential of bacteriocin-producing lactic acid bacteria for improvements in food safety and quality[J].L O’Sullivan,R.P Ross,C Hill.Biochimie.2002(5)

[8]杨瑾.乳酸菌细菌素分离纯化及生物学特性研究[D].浙江工商大学,2007.