过氧化物酶的制备方法

背景及概述^{[1][2] [3]}

催化过氧化氢分解而使其他氢供体氧化并生成水的一类酶。有不同的同工酶，有的底物专一性较强，有的无专一性。辅助因子也可不同，如谷胱甘肽过氧化物酶含硒；NAD+过氧化物酶含FAD；细胞色素c过氧化物酶含血红素等。

过氧化物酶广泛分布于各种植物组织中，在动物组织中较少见。动物的肝、肾中只有微弱的活性，在牛乳中已分离出过氧化物酶，在白细胞中含有髓性过氧化物酶，这就是脓具有过氧化物酶活性的原因。红细胞也含过氧化物酶，极少量的血，在过氧化物存在时，就能使联苯胺或愈创树脂氧化成有色物质，这就是检查粪、尿“隐血”的原理。

制备方法^[4-5]

CN201510367541.2提供一种可以用于工业化生产高回收率和纯化倍数可用于食品工业的乳过氧化物酶提取方法。本发明的目的是通过以下技术方案实现的：以牛乳清为原料，以硫酸铵盐析法为提取手段，确定硫酸铵盐析法中盐析条件下饱和度、盐析时间、转速、体系pH的工艺条件，并比较了硫酸 铵盐分级沉淀与直接一次用65％硫酸铵饱和度对LP酶活回收率和纯化倍数的影 响。采用超滤技术进行进一步纯化，最后透析脱盐和冷冻干燥制得成品，即原料乳清→硫酸铵盐析法分级沉淀提取乳过氧化酶→沉淀溶解→溶液使用超滤分 离→收集截留溶液→透析脱盐→冷冻干燥→乳过氧化物酶粗产品。具体的，本发明的一种采用超滤法辅助硫酸铵盐析提取乳过氧化物酶的方 法，包含以下步骤：

(1)硫酸铵盐析法分级提取乳过氧化物酶：

除去新鲜的牛乳中的脂肪和酪蛋白后得到乳清，在室温条件下，向乳清中 添加25-85％饱和度的硫酸铵，离心，去除沉淀，置于搅拌器上不断搅拌使硫酸 铵充分溶解，调节体系pH到5.5-8.5，放置2-10h使乳过氧化物酶完全沉淀， 4℃5000-10000r/min离心20min到沉淀即为乳过氧化物酶制品；

(2)超滤：

将步骤(1)中得到的沉淀使用适量去离子水复溶用超滤膜进行超滤分离， 以除去杂蛋白，收集截留溶液；

(3)脱盐处理：

将步骤(2)收集的截留溶液装入透析袋内进行脱盐；

(4)干燥：

将步骤(3)脱盐溶液冷冻干燥即制得乳过氧化物酶粗制品。

采用本发明提取的乳过氧化物酶粗产品为淡黄色粉状物，乳过氧化物酶的 酶活回收率和纯化倍数分别达到79.25-85.21％和4.08-4.58倍。通过上述提取工艺可以直接获得回收率较高的乳过氧化物酶，可以直接制 得天然的抗菌介质乳过氧化物酶制品，也可以将其制品作为天然防腐剂直接加 入到食品中。

通过上述提取方法可以直接获得回收率较高的乳过氧化物酶，可以直接制 得天然的抗菌介质乳过氧化物酶制品，也可以将其制品作为天然防腐剂直接加 入到食品和牙膏等日用品中。

二、辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase, HRP, E.C.1.11.1.7）是由酶蛋白和铁卟啉结合而成的一种糖蛋白，该酶由多个同功酶组成，分子量为40kDa，等电点为pH3.0‑9.0。HRP的辅基和酶蛋白吸收光谱分别在403nm和275nm，所以人们通常采用RZ值（即OD403nm  /OD275nm的比值）来表示该酶的纯度， RZ值越大，纯度越高。

HRP是最重要的医疗诊断用酶之一（J. Chromat. B 2004,803:237‑241），该酶不但用于多个生化检测项目，还广泛运用于免疫类试剂盒。除此之外，HRP还可用于工业废水的脱色（Chem. Technol. Biotechnol. 2009,84:126–132），过氧化物的去除以及含酚污水的处理（Biotechnol.  Bioprocess Eng. 2006,11:462–465）等。

在自然界中，辣根是HRP含量最高的植物，因此也成为生产HRP最具吸引力的原料。目前，从辣根中分离提取HRP的主要方法有：双水相萃取技术（Appl.  Biochem. Biotechnol. 1995, 53:147‑154）、反胶束萃取技术（Enzyme  Microb. Technol. 1996,18:332‑339）、电泳技术（J.  Biol. Chem. 1966,241:2166‑2172）及层析技术（J. Membr. Sci.  2003,211:101‑111）等。然而这些技术均存在一定的缺陷，其中，双水相萃取技术和反胶束萃取技术获得的产品纯度较低，且容易引起HRP的失活和变性；电泳技术和层析技术的成本昂贵，且难于工业放大。

CN201210112799.4提供一种操作简单、易于放大、产品纯度高的辣根过氧化物酶的超滤提取方法。本发明的技术方主要包括以下步骤：

（1）将辣根破碎、浸提、离心得到辣根过氧化物酶粗提液；

（2）将辣根过氧化物酶粗提液用截留分子量为70kDa‑100kDa的超滤膜进行超滤分离，得到辣根过氧化物酶超滤液；

（3）将辣根过氧化物酶超滤液用截留分子量为1‑30kDa的超滤膜进行超滤浓缩，得到辣根过氧化物酶浓缩液；

（4）将辣根过氧化物酶浓缩液脱水得到辣根过氧化物酶。

检测方法^[6]

一种猪肉中过氧化物酶的快速定量检测方法，其特征在于，所述的检测方法包括以下步骤：

(1)配制一系列以辣根过氧化物酶为标准酶的标准酶溶液；

(2)以过氧化脲为反应底物，以3,3’,5,5’-四甲基联苯胺为显色剂，以磷酸 二氢钠缓冲液为缓冲液，分别测试步骤(1)中所配制的标准酶溶液，测试的反 应温度为20-30℃，反应pH值为4.0-5.0，反应时间为30-90s，反应结束后加入 稀硫酸溶液，终止反应，获得反应产物溶液；

(3)将各反应产物溶液置于紫外分光光度计中，在450nm的吸收波长下分 别测定其OD值，获得辣根过氧化物酶浓度-OD值的标准曲线；

(4)测试待测猪肉中过氧化物酶反应后其反应产物溶液的OD值，根据标 准曲线计算出猪肉中过氧化物酶的浓度。图1为辣根过氧化物酶浓度-OD值的标准曲线图。

主要参考资料

[1] 农业大词典

[2] 中国医学百科全书·十七 生物化学

[3] 中国茶叶大辞典

[4] CN201510367541.2 一种采用超滤法辅助硫酸铵盐析提取乳过氧化物酶的方法

[5] CN201210112799.4 超滤提取辣根过氧化物酶的方法

[6] CN201511001061.0 一种猪肉中过氧化物酶的快速定量检测方法