利巴韦林的应用

背景及概述^[1][2]

利巴韦林(Ribavirin)为鸟苷、次黄嘌呤核苷类似物，是一种广谱抗病毒药物，对多种DNA和RNA病毒均有较好抑制作用。具有作用位点多、不易产生耐药性、疗效高、毒性低，副作用小等特点，现已用于多种病毒的治疗。在临床上用于治疗丙型肝炎病毒、呼吸道合孢病毒和拉沙热病毒感染。

制备^[1]

目前利巴韦林的工业化生产方法主要有微生物发酵法、酶法以及化学合成法。发酵法存在着生产周期长、容易污染杂菌、利巴韦林提取工艺复杂以及能耗高等缺点。化学合成法，反应条件苛刻，周期长，需要进行异构体的分离，成本居高不下，而且容易造成环境污染，所以，在工业化生产中受到一定的限制。酶法克服了发酵法和化学法的不足，同时生产成本较低，因而是较为有效的工业化生产方法。

其中，可以作为酶法合成利巴韦林的起始原料有鸟苷、肌苷、腺苷、胞苷或尿苷等。由于目前市场上鸟苷的生产成本较低，而且鸟苷作为反应底物时的分解产物为鸟嘌呤，它的溶解度极低(几乎不溶于水)，使得整个反应平衡倾向于利巴韦林的合成方向，因而可以得到更高的底物转化率。而未反应的底物鸟苷可以被离心后重新利用，反应副产物鸟嘌呤则可以用作药物阿昔洛韦的原料，所以鸟苷经常作为反应底物，选择PNPase作为催化剂。

酶或细胞作为催化剂由于易失活、难以反复使用、不易保藏，限制了工业化应用。全细胞固定化技术与游离酶和细胞催化相比具有很大优势。细胞 固定化避免了的酶的提取过程，操作相对容易，并且具有更高的操作稳定性。细胞固定化的方法有很多种，适用于细胞固定化的方法主要有包埋法，吸附法，交联法等，其中包埋法是最为常用的方法。由于细胞被固定化，减少了转化液中由游离细胞裂解产生的蛋白，降低了提取的困难，减少了提取成本。

在现有技术的基础上，研究一种高纯度利巴韦林的制备方法具有非常重 要的生产实践价值。

CN201610060219.X提供一种利巴韦林的制备方法，利用酶 催化法合成利巴韦林并对利巴韦林分离提取。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

本发明所用的利巴韦林生产菌，是将以枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis 168(ATCC23857))基因组为模板扩增表达的PNPase基因pupG(核苷酸序 列为序列表<400>1所示序列)，与pET-His质粒连接转入Escherichiacoli BL21(DE3)(CICC23796)中，获得的大肠杆菌重组菌BL21/pET-His-pupG。

一种利巴韦林的制备方法，具体方法为：

(1)以基因工程菌BL21/pET-His-pupG为菌种，使用发酵罐培养，获得 细胞；

(2)使用明胶包埋细胞，制成固定化重组表达PNPase的全细胞作为催 化剂，经酶促反应得到利巴韦林转化液；

(3)利巴韦林转化液提取

a.对利巴韦林转化液8000r/min离心5-10min，获得上清液，将上清 液加热至60-80℃，使用1-2％的活性炭脱色20-40min，过滤得滤清液；

b.将滤清液减压蒸发浓缩至1/4-1/3，在0-4℃结晶10-12h，过滤析 出的鸟苷，继续浓缩至利巴韦林即将析出为止，加入纯乙醇，至乙醇终浓度 90％左右，利巴韦林浓度35-45g/L，在85-95℃加热，充分搅拌溶解利巴韦林，趁热过滤，将上清在0-4℃结晶1-2d，过滤制得利巴韦林结晶；

c.将利巴韦林晶体重新溶解于90％的乙醇，利巴韦林浓度35-45g/L， 85-95℃加热溶解过滤，0-4℃结晶10-12h，即重结晶，经过两次重结晶后，离心分离、干燥即可得到利巴韦林纯品。

应用研究^[2-4]

吴丽君等人研究了抗病毒药物利巴韦林的肠道渗透性。方法：采用外翻肠囊法和Caco-2单层细胞模型，收集利巴韦林给药后不同时间点的肠囊液及Transwell小池基底端的接收液，用高效液相色谱仪进行检测，计算药物的表观渗透系数(Papp);并以高渗透性药物酒石酸美托洛尔为模型药物，用相同的方法测定其渗透性，以此为参照对利巴韦林的渗透性进行分析。

结果：外翻肠囊实验结果显示，利巴韦林的药物浓度对其Papp无影响，为被动转运，且药物的吸收无明显的肠段特异性，利巴韦林在肠道的Papp低于酒石酸美托洛尔。Caco-2单层细胞模型实验结果显示:利巴韦林的Papp值也低于酒石酸美托洛尔。结论：采用外翻肠囊法和Caco-2单层细胞模型测得利巴韦林的肠道渗透性低于酒石酸美托洛尔。

王建山研究了复方鳖甲软肝片、利巴韦林及聚乙二醇干扰素α-2b注射液联合治疗慢性丙型肝炎的临床效果。方法：选取河南省郑州市第六人民医院2016年7月耀2017年3月治疗的慢性丙型肝炎患者64例，依照治疗方案分为对照组(n=32)与观察组(n=32)。

对照组给予聚乙二醇干扰素α-2b注射液联合利巴韦林治疗，观察组给予复方鳖甲软肝片、利巴韦林及聚乙二醇干扰素α-2b注射液联合治疗。观察比较两组临床疗效与治疗前后肝功能指标[谷丙转氨酶(ALT)、脏硬度值(LSM)]。结果：两组临床疗效无明显差异(P>0.05)；治疗后观察组ALT、LSM低于对照组(P<0.05)。结论:复方鳖甲软肝片、利巴韦林及聚乙二醇干扰素α-2b注射液联合治疗慢性丙型肝炎，能改善肝功能，疗效显著。

主要参考资料

[1] CN201610060219.X 一种利巴韦林的制备方法

[2] 吴丽君，王颖，李志琳，邓黎，贺英菊.利巴韦林肠道渗透性的研究[J].华西药学杂志，2019(03):1-3.

[3] 王建山.复方鳖甲软肝片联合聚乙二醇干扰素ɑ-2b注射液及利巴韦林治疗32例慢性丙型肝炎的临床研究[J].北方药学，2019，16(06):81-82.

[4] 余静，付青青.金莲花颗粒联合利巴韦林治疗小儿手足口病的临床研究[J].现代药物与临床，2019，34(04):1050-1053.