酶法生产DL-酪氨酸的方法

背景技术

DL‑酪氨酸(DL‑Tyrosine，DL‑Tyr)是L‑酪氨酸的消旋体，在医药和化工领域有着相当广泛的应用。近年来，随着药物的深入开发研究，DL‑酪氨酸被用于药物合成原料，如肝病和心脏病的治疗药物，氨基酸输液和医学临床研究。另外DL‑酪氨酸作为制备合成D‑酪氨酸的原料，而D‑酪氨酸是一种非蛋白源手性氨基酸，在手性药物合成中具有非常广泛的应用。例如，以D‑酪氨酸为手性中间体合成的阿托西班是重要的保胎药，合成的脱乙酰茴香霉素具有抗原虫、抗变形虫、抗真菌、抗肿瘤和防止植物真菌等作用；合成的多肽药物用于恶性肿瘤的治疗；还可用于合成对肺部、中枢神经系统、关节、心内膜、眼、耳、皮肤、肠胃和泌尿系统具有极好疗效的消炎药等。

DL-酪氨酸，也被称为2-氨基-3-(4-羟基苯基)丙酸，是一种天然的氨基酸。它是酪氨酸的一种立体异构体，由L-酪氨酸和D-酪氨酸组成。DL-酪氨酸是白色结晶或结晶性粉末，具有苯酚的特征香气。DL-酪氨酸在常温下可溶于水和醇，微溶于乙醚。

目前，DL‑酪氨酸的制备主要是通过化学法合成的，文献报道涉及L‑酪氨酸化学法消旋的方法有方百盈等在常压回流条件性水溶液中对L‑酪氨酸进行消旋，消旋率达58％；王家荣等研究发现在乙酸酐的作用下，分别在碱性水溶液和纯乙酸溶剂中现对L‑酪氨酸100％消旋，收率90％。DL‑酪氨酸的化学消旋制备过程中使用乙酸和乙酸酐，为微毒性溶剂，其蒸气可与空气形成爆炸性混合物，遇明火、高能热能引起燃烧爆炸，存在较大的安全隐患。

生产方法^[1]

S1、构建重组表达载体pET32a‑PH0138，转化到大肠杆菌BL21(DE3)/pG‑KJE8中，获得重组工程菌BBAR；

S2、发酵表达BAR酶的重组工程菌BBAR获得湿菌体；在无菌环境下移种重组工程菌BBAR于一级培养基中，37℃、220rpm培养7h，OD600达到3～4后转接到二级培养基中，在37℃、220rpm培养4~5h，按照3.2％的接种量接入50L发酵罐中37℃培养，pH和溶氧上升时开启补料，菌浓度OD600达到20～25时，添加四环素，终浓度1mg/L，继续培养至菌浓度OD600为30时开始降温至30℃，加入0.2mM的IPTG诱导培养后放罐，离心获得湿菌体；

S3、在500L转化罐中进行300L体系转化。湿菌体添加量10g/L，称量3Kg湿菌体，用30L 0.1mol/L磷酸钾缓冲液(pH=7.0),重悬菌体，用超声波粉碎机或者高压匀浆机进行破胞处理后获得BAR粗酶液，备用；

S4、向500L转化罐中投加L‑酪氨酸15Kg，磷酸二氢钾1.5Kg，三水磷酸氢二钾4.2Kg，加适量水，开启搅拌，使L‑酪氨酸于水相中均匀分布，投加BAR粗酶液，再加入7.8gPLP，用水补体积至300L，调节pH至7.0，升温至80℃开始搅拌转化，转化过程取样检测产品比旋光，直至比旋光度为0°时终止反应，如图4所示，本实施例的反应时间为3h，获得DL‑酪氨酸水溶液。

对获得的DL‑酪氨酸水溶液进行分离检测：转化结束后，向转化液中添加4mol/L盐酸溶液，待DL‑酪氨酸完全溶解后，继续80℃保温30min。过板框压滤，收集清液，再用4mol/L NaOH缓慢调节pH至5.68，析出大量DL‑酪氨酸，抽滤，用纯水洗涤过滤烘干后得到DL‑酪氨酸12.5Kg，产品比旋光为0°，HPLC检测DL‑酪氨酸产品纯度为99.8％，转化率100％，收率83％。

参考文献

[1]绵阳晟氏健康科技有限公司. 酶法生产DL-酪氨酸的方法及广谱型氨基酸消旋酶、应用:CN202110290551.6[P]. 2021-06-04.