小鼠糖代谢PCR芯片

背景^[1-6]

小鼠糖代谢PCR芯片含有84个人糖代谢相关基因，包括：葡萄糖代谢（糖酵解、糖异生、TCA循环、戊糖磷酸途径及葡萄糖代谢调节）和糖原代谢（糖原合成、糖原降解和其代谢调节）。

生物芯片是微电子学、物理学、材料科学、化学等与生命科学相交叉的高科技，生物芯片的研究具有重大的基础研究价值和市场前景，各国政府的企业相继投以巨资进行研究开发。聚合酶链式反应(PCR)微芯片是运用微电子机械系统(MEMS)技术在硅片或玻璃片等基片材料上加工一系列的微管道、微反应室及微阀、微加热器、微传感器等功能单元，利用芯片集成度高和比表面积大的特性，在芯片上实现快速PCR扩增。

与传统PCR仪相比，PCR微芯片具有体积小、反应速度快、操作简便、价格低、样品用量少、无污染、节省试验成本、便于集成化、结果可靠。机体内的化学反应是在酶的催化下完成的。在细胞内这些反应不是相互独立的，而是相互联系的，一个反应的产物可能就是下一个反应的底物，这样构成一连串的反应，称之为代谢途径(pathway)，由不同的代谢途径相互交叉构成一个有组织有目的的化学反应网络(network)，称为代谢(metabolism)。

体内的代谢途径主要分为两类：一类是由大分子(多糖、蛋白、脂类等)不断降解为小分子(如CO2，NH3，H2O)的过程称之为分解代谢(catabolism)；另一类是由小分子(如氨基酸等)生成大分子(如蛋白质)的过程称之为合成代谢(anabolism)。分解代谢主要分三个阶段进行：阶段是由复杂的大分子分解为物质基本组成单位的过程，即糖、脂肪和蛋白质降解生成葡萄糖、脂肪酸、甘油和氨基酸。

第二阶段是由这些基本分子转变为代谢中间产物，即活泼的二碳化合物的过程，如上述葡萄糖、氨基酸和脂肪酸等降解为乙酰CoA，这期间有少量能量的释放，生成ATP；第三阶段是乙酰CoA氧化生成CO2和H2O的过程，这期间生成的NADH，FADH2通过氧化磷酸化过程，生成大量ATP。合成代谢一般不是分解代谢简单的逆向反应，而是由不同酶催化的，通常需要消耗ATP，还原供氢体多为NADPH。

很显然，分解代谢是一个发散的过程(divergent process)，而合成代谢是一个集合过程(convergent process)。在正常的机体内，代谢受着严格的调控(regulation)，处在动态平衡状态中，这种调节主要是通过各种代谢途径中关键的限速酶的活性变化来实现的。调控发生在两个水平上：一个是细胞内水平，主要由代谢底物、产物的多少来完成；第二个是整体水平，主要通过神经－内分泌系统来实现。

应用^[7][8]

小鼠糖代谢PCR芯片可用于小鼠模型糖代谢表达基因研究：

体内胰岛素的水平在糖尿病的发生、发展中起着决定性的作用。胰岛素作为直接控制血糖水平的激素，其合成、分泌和成熟受很多因素的影响。其中，蛋白原转换酶1／3（proprotein convertase1／3，PC1／3）、蛋白原转换酶2（proprotein convertase2，PC2）在胰岛素的翻译后修饰过程起着十分重要的作用；PC1／3、PC2共表达于β细胞；而在α细胞、δ细胞及PP细胞则只有PC2存在。PC1／3、PC2联合作用完成了对胰岛素的剪切，胰岛素原经剪切成为成熟的胰岛素和C肽，才能发挥生理作用。

此外，PC1／3、PC2在下丘脑和其它的内分泌器官中也有表达，对ACTH和α-MSH等内分泌肽的成熟起着同样的作用，PC1、PC2功能障碍将影响体内成熟激素的水平，进而可以影响机体对葡萄糖等物质的代谢过程。胰高血糖素样肠肽1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）是由小肠和大肠粘膜上皮的L型内分泌细胞分泌的一种参与调节血糖水平和短期摄食的内分泌型多肽。L型细胞来源于肠腺窝前体细胞，与胰岛的α细胞来源于共同的祖细胞，α细胞分泌的Glucagon和L型细胞分泌的GLP-1受同一基因Proglucagon的调控。

研究证明在Proglucagon基因的启动子序列上有Pax6的结合位点，即Pax6可能影响Proglucagon基因的转录调控。部分ENu诱变和筛选得到Pax6基因突变小鼠材料和方法：本研究对191只雄性C57BL／6J近交系小鼠进行ENU化学诱变，获得3172只G1代。

通过对G1代进行行为学、形态学、神经功能、学习记忆、听力、视觉生理、骨代谢、血糖和心功能等进行监测，筛选出595只与人类疾病相关的显性基因突变个体和117个可遗传品系，其中包括一个小眼品系DEBA。对此小眼小鼠品系DEBA利用微卫星标记技术和分子克隆技术，寻找突变基因，并对突变基因进行测序以确定突变位点，同时通过PCR和酶切的方法建立基因鉴定方法，Western Blot检测突变基因编码蛋白的表达。

参考文献

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[7]Pax6 is implicated in murine pituitary endocrine function[J].Cornelia A.Bentley,Miriam P.Zidehsarai,Justin C.Grindley,A.F.Parlow,Sara Barth-Hall,Veronica J.Roberts.Endocrine.1999(2)

[8]高艳.Pax6基因突变小鼠糖代谢异常分子机制的研究[D].郑州大学,2006.