非冻型组织DNA保存液

背景^[1-7]

非冻型组织DNA保存液能在室温条件下长期保存动物和植物DNA组织样品的保存液。它能迅速渗入细胞，通过高效抑制DNase的活性而长期保证DNA分子的完整性。迅速将新鲜组织剪碎（0.5立方厘米以下）按每克组织/10 mL本产品的比例浸没在适量本产品中，置于适当温度即可。

导致组织核酸降解的常见非酶因素：液中残留重金属离子磷酸二酯键的断裂、长期存放/光照产生的自由基磷酸二酯键的断裂、UV形成嘧啶二聚体、DEPC使RNA中没配对的腺嘌呤羧甲基化，但对双链核酸危害小、高温和低pH脱嘌呤反应（depurination）、EB导致可见光对DNA的光氧化（photooxidation）、酚其氧化产物使磷酸二酯键断裂甲酰胺溶液酸化后（pH 5）引起RNA降解、醚残留过氧化物使磷酸二酯键的断裂、醇残留重金属离子使磷酸二酯键的断裂。

实验操作：

1.估计完全浸没样品所需要Tissue DNAlocker的体积。

注：1g组织约需10 mL Tissue DNAlocker。

2.标记收集管并加入估计所需量的Tissue DNAlocker。

3.以最快速度将样品剪切成厚度小于0.5 cm的碎块。

注:鼠肝、肾和脾等小器官样品和没有蜡质保护层的植物样品可不需剪切而直接放入本产品中保存，有蜡质保护层的植物样品需要先将蜡表皮破坏。

4.将组织碎块完全浸没于收集管的Tissue DNAlocker中。

5.将收集管存放于温度适当的地方，保存温度不要低于4℃。

6.从存放处取出样品，用消过毒的镊子将组织碎块从保护液中取出。立即开始DNA提取。

特点：

1.保存时间长，可室温保存动植物组织长达两年，保护DNA不被降解。

2.安全可靠，本产品无毒无害，从DNAlocker保存的样品中提得的DNA可用于酶切和PCR等分子生物学实验。

3.使用简单，直接把新鲜的动植物样品浸在DNAlocker中即可。

4.可广泛用于各种动植物标本的野外采集。

应用^[8][9]

非冻型组织DNA保存液可用于组织样本的常温保存：

随着分子生物学技术在水产动物疾病诊断中应用的逐渐深入，动物组织中核酸的有效保存成为后续分子学研究的关键。一种安全、方便的水产动物样品保存液，将为水产动物样品采集及后续的分子研究提供方便。

以凡纳滨对虾为研究对象，以铵盐、乙醇为基础成份，通过不同的组合筛选一种常温下对凡纳滨对虾核酸有较好保存效果的保存液配方。将乙酸铵、甲酸铵、硫酸铵分别在0%、30%乙醇、50%乙醇和70%乙醇中溶解到饱和状态，添加EDTA和柠檬酸钠后调节pH(5.2、6.0、7.0)得到36种保存液。对凡纳滨对虾RNA溶液的保存实验结果显示，28℃下，70%乙醇为溶剂的饱和乙酸铵溶液和50%、70%乙醇为溶剂的饱和硫酸铵溶液保存3d回收的RNA28S和18S条带完整、界限清晰。

在以上结果的基础上以不同浓度乙醇为溶剂，配制不同pH的硫酸铵和乙酸铵饱和溶液，测试其对凡纳滨对虾组织的渗透效应和对RNA在常温条件下的保护作用。结果表明，乙酸铵比硫酸铵在乙醇中的溶解度高的多，而且其铵离子的摩尔浓度在0—80%乙醇溶剂中比较稳定。乙酸铵比硫酸铵能更快渗透到整体的对虾组织中，并达到更高的浓度。

硫酸铵在70%乙醇中的饱和溶液和乙酸铵在50%乙醇中的饱和溶液（pH6.0）保存的RNA条带完整清晰，保存效果较好.推荐50%乙醇溶液中的饱和乙酸铵溶液（pH6.0）作为样品采集及常温保存的保存液。该结果为野外样品采集及常温运输提供一种有效方法。为探索一种可应用于现场快速采集核酸的简易工具，本论文以纤维素材料的木、竹牙签为基质，并分别经过氨基化处理和季氨基化处理，以FTA膜片为对照，吸取核酸溶液后分别用去离子水、TE buffer(pH8.0)、1PCR buffer进行洗脱回收。

参考文献

[1]Comparison of short-term and long-term protocols for stabilization and preservation of RNA and DNA of Leishmania,Trypanosoma,and Plasmodium[J].Frank L.Basiye,Gerard J.Schoone,Marcel Beld,Rene Minnaar,Joseph N.Ngeranwa,Monique K.Wasunna,Henk D.F.H.Schallig.Diagnostic Microbiology&Infectious Disease.2011(1)

[2]Simple salting-out method for DNA extraction from formalin-fixed,paraffin-embedded tissues[J].Elena R.C.Rivero,Adriana C.Neves,Maria G.Silva-Valenzuela,Suzana O.M.Sousa,Fabio D.Nunes.Pathology-Research and Practice.2006(7)

[3]Qualitative and quantitative studies on the relative virus load of tails and heads of shrimp acutely infected with WSSV[J].S.V Durand,R.M Redman,L.L Mohney,K Tang-Nelson,J.R Bonami,D.V Lightner.Aquaculture.2003(1)

[4]Fluorescence resonance energy transfer[J].Robert M Clegg.Current Opinion in Biotechnology.1995(1)

[5]Successful extraction of DNA from archived alcohol-fixed white-eye fish specimens using an ancient DNA protocol.de Bruyn M,Parenti L R,Carvalho G R.Journal of Fish Biology.2011

[6]Quantitative PCR using the ampliSensor assay.Wang CN,Wu KY,Wang HT.PCR Primer:A Laboratory Manual.1995

[7]Comparison of frozen and RNALater solid tissue storage methods for use in RNA expression microarrays.Mutter George,Zahrieh David,Liu Chunmei,Neuberg Donna,Finkelstein David,Baker Heather,Warrington Janet.BMC Genetics.2004

[8]Purification and characterization of infectious myonecrosis virus of penaeid shrimp.Poulos Bonnie T,Tang Kathy F J,Pantoja Carlos R,Bonami Jean Robert,Lightner Donald V.The Journal of general virology.2006

[9]陈大菾.对虾样品常温保存液的筛选及核酸快速采集工具的制备[D].上海海洋大学,2014.