非冻型血液DNA保存液

背景^[1-6]

非冻型血液DNA保存液在室温条件下长期保存用于DNA提取的血液样品的保存液。它通过裂解细胞并高效抑制DNase的活性而达到长期保证DNA分子的完整性的效果。

操作流程：

1.非冻型血液DNA保存液250mL成分根据要保存的各样本的体积，计算出所需RNAwait用量。RNAwait的用量应当是组织体积的10倍（如100mg组织约用1ml RNAwait）；离心收集2×106细胞RNAwait的用量是1ml。

2.将RNAwait按需要量分装入自备保存管中；

3.保存时先将样本浸入RNAwait后置4℃冰箱过夜（4℃过夜是必需的，这样可使RNAwait完全渗入到组织中），然后转移到-20℃冰箱（RNAwait在-20℃时仍为液态，有结晶析出，是正常情况）；或者在4℃冰箱过夜后，从RNAwait中取出组织块，转移到-80℃冰箱。在RNAwait中保存的标本，反复冻融至室温20次不影响RNA的质量。

产品特点：

1.非冻型血液DNA保存液250mL成分操作简单,将组织剪薄浸没在RNAWAIT中即可使其RNA不被降解。

2.替代液氮,使样品的保存不需液氮,干冰或-80℃冰箱,尤其适用于临床和野外样品的快速和大规模采集。

完整,因RNAwait能迅速抑制组织中RNA酶的活性,故从中提取的RNA的质量跟液氮保存的样品相比不相上下。

4.方便运输,处理过的样品能在25℃保存一周,使样品邮寄和运输变得容易和便宜,有利学术合作和交流。

5.反复冻融,经RNAwait处理的样品可反复冻融20次,其间可对样品进行各种处理而不影响最终提取的RNA的质量。

6.结果准确,RNAwait进入细胞十分快速,基因表达在发生应急改变前就得以锁定,故RNA分析更能反映取样时的真况。

7.可比性强,RNAwait能减少大规模样品处理中的误差,增加各次实验数据间的可比性,对大规模基因表达谱的分析尤其有用。

8.兼容性广,处理过的样品可以使用TRIzol等试剂提取其RNA,样品还可直接用于组织切片,免疫学和流式细胞分析而不影响RNA的质量。

应用^[7][8]

非冻型血液DNA保存液可用于血液循环DNA长期保存：

循环DNA（circulating DNA），又称为游离DNA（cell-free DNA），是存在于血液（血浆或血清）、脑脊液以及滑膜液等体液中的细胞外DNA。随着微量DNA定量检测技术的飞速发展，循环DNA，特别是血液循环DNA，作为一种微创检查中的生物大分子标志物，日益受到人们的关注。人血液循环DNA含量的变化在多种类型疾病的诊断、疗效观察和预后判断中具有重要价值。

然而，由于血液采集、分离、保存方式和样本选择的不同，以及循环DNA提取、纯化和定量方法的差异，各研究结果间缺乏可比性，目前关于健康人血液循环DNA水平和正常参考值范围，尚未见大样本的研究报道。目的建立含有内参照物的血液循环DNA定量检测方法，对健康人血液循环DNA水平进行初步研究，确定其正常参考值范围。方法自行设计并合成人工双链DNA片段，重组到pMD18-T质粒载体中，经基因克隆和多步筛选实验，构建重组质粒，提取质粒DNA，紫外分光光度法对其进行定量，梯度稀释获得标准内参照物。

通过比较四种不同的DNA提取方法对重组质粒DNA的提取效率，选择合适的血液循环DNA提取方法。采用实时荧光定量PCR技术，以三条引物（共用一条下游引物）和两条Taqman荧光探针，同时扩增血浆和血清中的目的基因（人看家基因β-actin）和内参照物（重组质粒DNA），以扩增效率为指标，确定双重实时荧光定量PCR反应中的Mg2+和下游引物的浓度。

由已知的标准内参照物浓度计算得到目的基因的浓度。针对不同的血浆血清用量（200、100、50、10、2和1μl）进行定量检测，确定该方法的敏感性。以紫外分光光度法定量的人基因组DNA投入空白血浆和血清中，以双重实时荧光定量PCR进行定量检测，确定其准确性。针对不同程度稀释的血浆血清DNA样品进行定量检测，确定检测方法的稳定性，并对该检测方法的重复性进行评价。

参考文献

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