一步离心式石蜡清除剂

背景^[1-6]

一步离心式石蜡清除剂用于快速去除石蜡包埋组织切片中的石蜡，用于提取DNA前的预处理。近10年来，现代分子生物学技术越来越广泛地被用于人类疾病研究的诸领域，为了解病理状态下基因组DNA的变化积累了新资料。目前认为，人类基因组并非人们想像的那样稳定，诸如基因重排、扩增、缺失，突瘘和DNA甲基化类型改变等时有发生，这些改变对于基因表过和调控，以及疾病过程的发展与转归等方面均具有重要意义。医院病理科档案中积存的大量石蜡包埋组织，是一个可靠的分子生物学研究的材料来源。

在石蜡切片上进行原位杂交或原位PCR分析的分子生物学方法，是免疫细胞化学技术的重要延伸。通过对DNA或mRNA分析亦可直接证实或补充免疫细胞化学的发现。通过对DNA或mRNA分析亦可直接证实或补充免疫细胞化学的发现。这些对形态学家较为熟悉的原位分子生物学技术，从石蜡包埋组织中提取DNA的基本步骤，是在常规DNA提取方法的基础上改良和演变而业。

Goelz等（1985）最先提出的石蜡包埋组织DNA提取技术，是用机械的方法破碎组织，切除多余的石蜡，进入含SDS和高浓度蛋白酶K（１mg/ml）的提取缓冲液加温孵育，然后进行苯酚和氯仿抽提。

所得DNA虽不完整，但可被限制性内切酶切割，因而适于点杂交，印迹杂交等多种分了生物学实验。首先通过组织切片和二甲苯和脱蜡，保证了组织的完全破碎，使细胞与消化液充分接触，使DNA释放和蛋白去除更加完全；其次通过两步消化的方法，将不适于做分子杂交的降解的DNA小段去除，仅保留那些可螺旋化的完整的DNA分子，从而提DNA质量，适于做Sorthern印迹杂交分析。

提高DNA提取质量的方法：蜡块的选择从福尔马林固定的组织中未能提出完整的高分子量DNA的重要原因之一，是应用了固定不充分的组织。因此，在DNA提取前应检查组织切片。如果有自溶、退变或组织结构不清，大片出血等改变的蜡块不能用；若有明显坏死存在的蜡块，不用或将坏死部分切去后再用。尽可能地选用新近标本，缓冲福尔马林、丙酮和乙醇固定者。

应用^[7][8]

一步离心式石蜡清除剂可用于福尔马林固定石蜡包埋组织DNA提取实验中的脱蜡处理：

福尔马林固定石蜡包埋组织(formalin-fixed and paraffin-embedded tissue,FFPET)因其能够较长时间地保存组织或制备检验所需的组织标本,因此在临床病理检验、法医病理学鉴定和医学科学研究过程中常被用到。这一处理过程虽然能够使DNA免受内源性核酸酶的破坏,但是甲醛不仅会导致DNA链的断裂和降解、DNA发生脱嘌呤以及DNA-蛋白质的交联,造成被固定组织DNA质量的改变,而且其在模板DNA中的残存也严重影响着PCR扩增。

研究表明,影响FFPET DNA提取的因素有很多。如固定液的种类、固定时间、切片厚度、切片存储时间以及不同的提取处理方法等均可影响FFPET提取DNA的质量,从而影响其基因分型。通过优化蛋白酶消化条件、增加循环次数或采用巢式PCR等,虽然可以提高扩增产物量或扩增特异性,但并未明显改善其检出率；通过缩短扩增产物片段长度,如开发扩增片段较小的miniSTR(mini-short tandem repeat)系统或SNP(single nucleotide polymorphism)系统,虽然提高了对降解DNA检材的分型成功率,但仍然普遍存在诸如等位基因或位点丢失、不平衡峰、伪峰等问题。

此外miniSTR系统扩增片段长度不可能无限的减小(基本在50-200bp之间)；SNP分析技术要达到与目前所用STR试剂盒一样的识别率,所需的位点数较多等缺点,也限制了其在实际检案中的应用。本研究基于法医学检案的实际需要,结合前人的研究成果,通过对醋酸铵盐析法进行改进,并结合PCR前修复技术提高模板DNA质量,以期为法医学实际检案中FFPET DNA的STR分型提供一种新的方法。

材料与方法1、死后24h内尸体肾脏组织(1cm×1cm×0.5cm)及心血(15ml),均由中国医科大学法医病理学教研室提供。2、经10%中性福尔马林溶液固定1d、3d、5d和7d后,进行石蜡包埋,常规切片备检。3、血液DNA提取,新鲜组织DNA提取,FFPET切片DNA提取,对醋酸铵盐析法影响因素进行探讨,并将其与酚／氯仿法、Chelex-100法进行比较,同时探讨法医学可以实现成功分型的最小FFPET检材量。4、对改良醋酸铵盐析法所提基因组DNA采用修复酶进行模板DNA的修复。

结果1、不同脱蜡方法提取基因组DNA的PCR-PAGE结果显示未脱蜡和脱蜡均可得到清晰谱带；但是从谱带亮度上看95℃水浴脱蜡谱带最亮,65℃水浴脱蜡次之,后依次为二甲苯脱蜡、微波脱蜡、不脱蜡。

参考文献

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[7]Real-Time PCR Analysis of DNA and RNA Extracted from Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded Biopsies[J].Ulrich Lehmann,Hans Kreipe.Methods.2001(4)

[8]周勤虎.醋酸铵盐析法和DNA修复技术在福尔马林固定石蜡包埋组织DNA多态性分析中应用的研究[D].中国医科大学,2010.