mRNA提取试剂盒

背景^[1-6]

mRNA提取试剂盒用于从细胞、组织、新鲜血液和病毒中提取200 bp及以下的small RNA，用LB10裂解样品后，加入氯仿，溶液分为无色水相和粉红色有机相，RNA在水相中；用RNA硅胶膜离心柱特异地吸附水相中的大分子量RNA(28S rRNA,18S rRNA,mRNA），流出液中的small RNA用miRNA硅胶膜离心柱特异地吸附。与其它miRNA提取方法相比，该试剂盒裂解能力强、提取量高、专一性强，应用范围广。

mRNA提取试剂盒包括一套用于固、液相分离的分离装置；所述分离装置中至少包含一层纤维素固相载体；该试剂盒还包括下述所有成份：至少有一管为细胞或组织裂解液；至少有一管为生物素化Oligo(dT)探针；至少有一管为结合缓冲液；至少有一管为洗脱缓冲液。该试剂盒操作简便、快速、高效，适合用于生物样品中mRNA的分离提取。

其主要特征在于分离装置中采用纤维素为固相载体，利用融合蛋白CBD-SA作为生物桥联剂，以生物特异性偶联法代替传统的物理吸附法和化学键合法活化纤维素固相载体，活化后的固相载体能够高效率的结合生物素化的试剂，可用于蛋白或核酸的分离。构建cDNA文库、蛋白质的体外翻译和RT-PCR方法检测稀有的mRNA等研究常常需要从总RNA中分离mRNA，mRNA只占总RNA的1%左右，但由于带poly(A)尾巴，所以可以通过与Oligo(dT)的亲和结合而与其RNA（如rRNA、tRNA等）分离开。

使用方法：将0.5 mL结合液加入到一管装有1 mg Oligo(dT)纤维素的离心管中，放置5分钟后离心吸弃上清后待用。将制备的总RNA 100μL加热到65℃5分钟后加入等体积的结合液，转移到装有Oligo(dT)纤维素的离心管中，颠倒混匀数次，离心后将上清转移到一个离心管中。用0.5 mL结合液，混匀后4℃200 g离心5分钟，小心弃上清。重复上步洗3-5次，用RNase-free水洗脱mRNA，用微量核酸沉淀剂沉淀回收mRNA。

mRNA提取试剂盒具有下列特点：

1.直接从总RNA中提取mRNA，即开即用，非常方便。

2.处理量大，一次可以处理10μg总RNA。

3.操作简单，只需要离心就可以完成，免去了灌柱、洗柱等麻烦。

4.得到的mRNA可以直接用于构建cDNA文库、蛋白质的体外翻译和RT-PCR。

应用^[7][8]

mRNA提取试剂盒可用于游离mRNA的提取实验：

在基于存在形式的人精浆游离mRNA和microRNA提取实验中由于精浆小体直径大部分在0.10μm以上，本实验拟采用0.10μm滤膜对精浆标本微过滤（microfiltration,MF）截留大部分精浆小体，用于提取cfs-mRNA，检测这种基于存在形式的提取方法的提取量，同时也是对cfs-mRNA的存在形式进行证实性研究。

收集精液参数正常的男性精液标本，用0.10μm滤膜过滤后用TrizolLSReagent提取cfs-mRNA，通过荧光定量RT-PCR，扩增管家基因β-actin（ACTB）、睾丸组织特异基因DDX4、PRM2、附睾特异性表达基因WFDC9、前列腺特异基因TGM4、精囊腺特异基因SERPINA5，与不过滤直接应用TrizolLSReagent提取cfs-mRNA比较，分析0.10μm滤膜对cfs-mRNA提取含量的影响。

结果：将正常男性精浆标本通过0.10μm滤膜后再采用TrizolLSReagent提取cfs-mRNA，与未过滤提取的mRNA比较，分别有93.9%±15.7%（Mean±SE）ACTB、99.1%±12.5%DDX4、76.9%±18.5%PRM2、88.1%±29.6%WFDC9、150.2±73.6%TGM4、98.6%±17.8%SERPINA5被提取，各基因水平均无明显降低（P>0.05,n=6,Paird-Samplest-test)。说明大部分含cfs-mRNA的精浆小体被0.1μm滤膜截留下来，滤膜上精浆小体内cfs-mRNA足以稳定被检测出。

结论：利用0.10μm滤膜对精浆小体进行富集，进而再提取cfs-mRNA，这种基于存在形式的提取方法，不会对cfs-mRNA量产生明显降低，因此可有效的提取cfs-mRNA。且本实验结果与前期课题组对通过精浆小体的获取及过滤实验等结果一致，表明大部分精浆小体不能通过0.10μm滤膜，同时证实cfs-mRNA主要被包裹在精浆小体中。析经滤膜过滤后所提取的cfs-mRNA的纯度和DNA污染等。

方法：分别通过未过滤直接用TrizolLSReagent提取方法，和微过滤（microfiltration,MF,直径0.1μm）后TrizolLSReagent对留于滤膜上的精浆小体进行裂解提取的方法，提取cfs-mRNA。通过分光光度计测定两种方法提取的mRNA纯度（OD260/280）；通过毛细血管电泳对所提取的RNA片段分布进行分析；荧光定量PCR扩增DDX4，定量检测两种方法提取的cfs-mRNA中基因组DNA的残留量。提取滤膜上及滤液中的DNA，荧光RT-PCR定量检测DNA残留量，并与精浆DNA总量进行比较。

参考文献

[1]Plasma MicroRNA Profiling Reveals Loss of Endothelial MiR-126 and Other MicroRNAs in Type 2 Diabetes[J].Anna Zampetaki,Stefan Kiechl,Ignat Drozdov,Peter Willeit,Ursula Mayr,Marianna Prokopi,Agnes Mayr,Siegfried Weger,Friedrich Oberhollenzer,Enzo Bonora,Ajay Shah,Johann Willeit,Manuel Mayr.Circulation Research.2010(6)

[2]A robust methodology to study urine microRNA as tumor marker:microRNA-126 and microRNA-182 are related to urinary bladder cancer[J].Merle Hanke,Kai Hoefig,Hartmut Merz,Alfred C.Feller,Ingo Kausch,Dieter Jocham,Jens M.Warnecke,Georg Sczakiel.Urologic Oncology:Seminars and Original Investigations.2010(6)

[3]MicroRNA markers for forensic body fluid identification obtained from microarray screening and quantitative RT-PCR confirmation[J].Dmitry Zubakov,Anton W.M.Boersma,Ying Choi,Patricia F.Kuijk,Erik A.C.Wiemer,Manfred Kayser.International Journal of Legal Medicine.2010(3)

[4]ADAM7 is associated with epididymosomes and integrated into sperm plasma membrane[J].Jeong Su Oh,Cecil Han,Chunghee Cho.Molecules and Cells.2009(5)

[5]Identification of forensically relevant body fluids using a panel of differentially expressed microRNAs[J].Erin K.Hanson,Helge Lubenow,Jack Ballantyne.Analytical Biochemistry.2009(2)

[6]Tumor-derived microvesicles modulate the establishment of metastatic melanoma in a phosphatidylserine-dependent manner[J].Luize G.Lima,Roger Chammas,Robson Q.Monteiro,Maria Elisabete C.Moreira,Marcello A.Barcinski.Cancer Letters.2009(2)

[7]Microarray profiling of microRNAs expressed in testis tissues of developing primates[J].Naihong Yan,Yilu Lu,Huaqin Sun,Weimin Qiu,Dachang Tao,Yunqiang Liu,Huijiao Chen,Yuan Yang,Sizhong Zhang,Xiang Li,Yongxin Ma.Journal of Assisted Reproduction and Genetics.2009(4)

[8]王立平.基于存在形式的人精浆游离mRNA和microRNA提取[D].华中科技大学,2012.