RNA长效保存液

背景^[1-6]

RNA长效保存液是一种能高效抑制RNase活性的新型小分子混合物,用于防止RNase对RNA的降解作用。组织RNA长效保护液从新鲜组织细胞中提取RNA时，由于各种原因若不能马上处理样品，即使－70℃保存样品中的RNA也不稳定容易降解，而液氮保存既昂贵又不方便。RNA保护液是一种无毒的样品储存液，能迅速渗入新鲜组织细胞的胞浆迅速而强烈灭活生物样品中的RNA酶，抑制RNA降解。

标本在4℃或室温长时间保存，其中的RNA不会降解，免去使用液氮或超低温冰箱的不便，从而有效地解决了样品保存及运输的问题。随后可采用当今世界上各种常见的RNA抽提试剂如RNAtrip、TRIzol或用户自备试剂提取样品RNA。

组织RNA长效保护液使用范围：

1.生物样品已采集完毕，但由不可预测原因不能立即进行RNA提取。

2.异地生物标本保存和运输。如野外采集动植物标本，异地运输或邮寄标本等。

3.没有低温条件或低温设备不可用。如冰箱故障意外停电等。

4.RNase含量特别丰富的组织如胰腺或脾脏，预先用RNA保护液进行预处理，可以获得很好的结果。

5.珍贵样品，取出部分RNA保护液处理过的样品提取RNA，剩余样品可继续冻存于保护液中。可反复冻融并多次取样20次以上。

6.RNA表达分析，不同实验RNA表达的时序变化可立即被RNA保护液固定，减少样品误差。

适用：新鲜生物组织和细胞，如动物组织、植物组织、临床标本、胚胎、真核细胞、血液、细菌、酵母菌，病毒等。但不能用于已经保存冷冻组织和冻融后的组织。

产品特点：

1.高效抑制RNase，保存在RNAsaver中的RNA可以在抵抗100 ng/mL的RNase A的降解作用达36小时，

效果比人胎盘RNase抑制蛋白和RVC更有效。

2.耐高温,100℃保温30分钟后活性不受任何影响。

3.抗氧化，不需要DTT。

4.有效pH范围广。

5.产品为淡红色液体，可以-20℃保存两年。

RNA长效保存液将直接用于溶解RNA沉淀(跟使用RNase-free水一样)，然后放置在适当温度下保存(一般在-20℃)。保存在RNApreserve中的RNA可以直接电泳，不影响Northern杂交。但由于RNA保存液会抑制后续酶反应，所以如果RNA要用于RT-PCR等反应，需要预先用LiCl沉淀去除RNA保存液(将1/3倍体积的LiCl加入溶液中，4℃12000～15000g离心20-30分钟，弃上清，用75%乙醇洗一次既得RNA沉淀)。

应用^[7][8]

RNA长效保存液可用于RNA及RNA样本的长期保存：

RNA固定剂、固定时间及温度对RNA病毒感染组织总RNA的完整性、得率及病毒RNA扩增的影响。以及固定剂和固定时间对石蜡包埋组织中RNA降解和标本病理形态学的影响。方法：取汉坦病毒76—118株接种乳鼠的感染组织，以沉淀脱水类固定剂100％甲醇、75％乙醇、100％丙酮以及醛类固定剂4％的多聚甲醛磷酸缓冲液(4％PFA)、10％福尔马林共五种固定剂，分别在4℃和室温下固定病毒感染组织6h、12h、24h和48h后，对固定后标本进行如下检测或处理：

1、从固定6h～48h后的标本中直接提取组织总RNA，用琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性；以分光光度计测吸光度计算组织总RNA得率；用巢式RT—PCR扩增病毒RNA序列，电泳检测PCR产物并行灰度扫描。对RNA得率及PCR产物电泳所测灰度值进行统计学分析。2、将固定后的病毒感染组织标本进行石蜡包埋长期保存。对石蜡包埋组织切片后HE染色，镜下观察各种固定剂对组织病理形态学的影响。

从长期保存的各种方式固定后石蜡包埋组织中以RT—PCR扩增出不同片段长度的病毒RNA及β-actin RNA序列，以获得产物长度或对长片段扩增的可重复性及假阴性的多少，来反映各种固定方式对病毒RNA和细胞总RNA降解的影响。结果：

1、病理切片结果显示，经10％福尔马林和4％PFA固定的石蜡切片，组织结构完整清晰。其他三种沉淀脱水类固定剂固定后组织有不同程度收缩，但不影响组织病理形态学检测，其中甲醇固定的收缩程度最小。

2、固定标本直接提取RNA结果，(1)RNA完整性：与立即冰冻或新鲜组织比较，100％甲醇固定24h，RNA完整性损伤不明显；75％乙醇、100％丙酮固定12h后RNA开始出现损伤带，24h出现明显的损伤；而10％福尔马林、4％PFA固定6h就开始出现明显的损伤，固定24 h几乎很难看清RNA条带。

(2)RNA得率析因分析结果显示，不同固定剂、固定时间、固定温度下固定的组织中所提RNA的得率有显著性差异(P＜0.01)，沉淀类固定剂固定后组织RNA得率明显高于醛类固定剂(P＜0.01)；三种沉淀类固定剂之间差别无统计学意义伊>0.01);4%PFA高于10%福尔马林(P<0.01)。固定剂、固定时间和固定温度之间有显著性交互作用(P<0.01)，4℃甲醇固定6h的RNA得率最高，10%福尔马林在室温下固定48h得率最低。

参考文献

[1]Rapid differentiation between Hantaan and Seoul viruses by polymerase chain reaction and restriction enzyme analysis.Kim EC,Kim IS,Choi Y,et al.Journal of Medical Virology.1994

[2]Detection of HCV-RNA in paraffin-embedded liver biopsies from patients with autoimmune hepatitis.Savage K,Dhillon AP,Schmilovitz-Weiss H,et al.Journal of Hepatology.1995

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[4]Epstein-Barr virus and human hepatocellular carcinoma.Akhter S,Liu H,Prabhu R,et al.Cancer Letters.2003

[5]Relman.Detection and Identification of Previously Unrecognized Microbial Pathogens.David A.Emerging Infections.1998

[6]Relman.Detection and Identification of Previously Unrecognized Microbial Pathogens.David A.Emerging Infections.1998

[7]Differentiation between porcine epidemic diarrhea virus and transmissible gastroenreritis virus in formalin-fixed paraffin-embedded tissues by multiplex RT-nested PCR and comparison with in situ hybridization.Jung K,Kim J,Kim O,et al.Journal of Virology.2003

[8]贺莉萍.RNA病毒感染组织标本保存方法探讨[D].武汉大学,2004.