非酶DNA清除剂

背景^[1-7]

非酶DNA清除剂是一种使用破壁酶(Lyticase)消化去除酵母细胞壁，然后采用一种新型的酵母质粒纯化柱实现从酵母细胞中进行小量质粒快速抽提的试剂盒。非酶DNA清除剂本实验方法的基本原理是，在高盐状态下，硅胶膜专一性地吸附DNA；而在低盐或水溶液状态下，DNA被洗脱下来。此法简便快捷，可在30分钟内同时提纯二十多个样品。

从3～5ml培养过夜的含高拷贝质粒的菌液中可以获得10～20μg高纯度的质粒DNA，用于酶切、转化、DNA自动测序和手工测序等。用Trizol等方法提取的细胞总RNA样品中经常会含有基因组DNA污染，这些污染会影响下游的RT-PCR和Northern杂交等实验。目前最常用的RNase-freeDNase处理方法因DNase中所含残留的RNase能破坏RNA完整性而具有很大缺陷。开发的非酶DNA清除剂不但彻底避免了RNase-free DNase的这一缺陷，同时还具有操作快速，稳定性好和性价比高等诸多优点，完全可以替代价格昂贵的RNase-free DNase。

特点：

1无需酚氯仿抽提，无需酒精沉淀，12个样品只需约1-1.5小时即可完成。

2试剂盒提供了破壁酶(Lyticase)，酵母收集后，加入Lyticase消化去除细胞壁，接着采用传统碱裂法裂解细胞，然后将获得的上清液转移至结合柱结合DNA，经过离心快速洗涤，最后用洗脱液洗脱出酵母质粒DNA。

3由于采用了高浓度的破壁酶，无需再使用玻璃珠，可以避免因为玻璃珠的机械作用带来的酵母基因组DNA污染。

非酶DNA清除剂纯化柱可以结合的质粒量的上限约为20微克。质粒DNA的产量依赖于酵母携带质粒的拷贝数，酵母菌株以及生长条件。通常酵母质粒的拷贝数较低，1.5-5ml培养过夜的酵母抽提获得的质粒DNA量约为1-3微克左右。高拷贝酵母质粒抽提时的得率会大大提高。抽提所得质粒的量与酵母培养浓度、质粒拷贝数、酵母品系等因素有关。

应用^[8][9]

非酶DNA清除剂可用于高纯度RNA提取中的DNA的去除：

在拟南芥Flowering Locus T基因生物功能及其mRNA移动能力研究需要提取高纯度的RNA。拟南芥开花诱导基因网络主要是通过光周期途径(photoperiod pathway)、春化途径(vernalization PathWay)、自发途径(autonomous pathway)和赤霉素途径(GA pathway)等4个途径进行的，有很多相关基因起作用，其中拟南芥FLOWERING LOCUS T(FT)基因在其成花信号基因网络中起很重要的整合作用，在光周期诱导途径中，拟南芥叶片中光受体与相关感光节律基因构成的生物节律钟感受光周期信号，调控CONSTANS(CO)基因节律表达，CO基因在合适光周期调控下，将开花信号传导至FT基因，引起叶片中FT基因表达，FT基因表达产物、FT mRNA单独或相互作用，经韧皮部长距离运移到顶端分生组织，调节下游分生组织及花器官决定基因形成花芽开花。

FT基因在光周期及其它开花诱导途径中起开花信号关键整合作用，也是现在已知在叶片中感受开花信号而长距离作用于顶端分生组织的基因。本试验对拟南芥FT基因的研究取得了如下研究结果：采集16h长日照条件下始花期野生型拟南芥叶片为样本，采用异硫氰酸胍法提取总RNA，利用RT-PCR法成功克隆得到拟南芥开花诱导遗传网络中关键的枢纽基因FLOWERING LOCUST(FT)，分析得到完整FT基因阅读框序列，完整阅读框架长度为528bp，经与NCBI GeneBank数据库比对序列完全正确。

参考文献

[1]Export of FT Protein from Phloem Companion Cells Is Sufficient for Floral Induction in Arabidopsis[J] . Johannes Mathieu,Norman Warthmann,Frank Küttner,Markus Schmid.  Current Biology . 2007 (12)

[2]INTEGRATIVE PLANT BIOLOGY: Role of Phloem Long-Distance Macromolecular Trafficking[J] . Tony J. Lough,William J. Lucas.  Annual Review of Plant Biology . 2006

[3]Conservation and Divergence of FCA Function between Arabidopsis and Rice[J] . Jeong-Hwan Lee,Young-Sil Cho,Hoon-Seok Yoon,Mi Chung Suh,Jihyun Moon,Ilha Lee,Detlef Weigel,Choong-Hyo Yun,Jeong-Kook Kim.  Plant Molecular Biology . 2005 (6)

[4]The SOC1 MADS‐box gene integrates vernalization and gibberellin signals for flowering in Arabidopsis[J] . JihyunMoon,Sung‐SukSuh,HorimLee,Kyu‐RiChoi,Choo BongHong,Nam‐ChonPaek,Sang‐GuKim,IlhaLee.  The Plant Journal . 2003 (5)

[5]FY Is an RNA 3′ End-Processing Factor that Interacts with FCA to Control the Arabidopsis Floral Transition[J] . Gordon G Simpson,Paul P Dijkwel,Victor Quesada,Ian Henderson,Caroline Dean.  Cell . 2003 (6)

[6]Potato virus X: a model system for virus replication, movement and gene expression[J] . Jeffrey S.Batten,ShigeoYoshinari,CynthiaHemenway.  Molecular Plant Pathology . 2003 (2)

[7]The VERNALIZATION INDEPENDENCE 4 gene encodes a novel regulator of FLOWERING LOCUS C[J] . Hua Zhang,Steven Van Nocker.  The Plant Journal . 2002 (5)

[8]The VERNALIZATION 2 Gene Mediates the Epigenetic Regulation of Vernalization in Arabidopsis[J] . Anthony R. Gendall,Yaron Y. Levy,Allison Wilson,Caroline Dean.  Cell . 2001 (4)

[9]刘旭新. 拟南芥Flowering Locus T基因生物功能及其mRNA移动能力研究[D].西北农林科技大学,2008.