柱式DNA清除剂

背景^[1-7]

柱式DNA清除剂可用于细胞总RNA样品中基因组DNA污染的去除。目前zui常用的RNase-free DNase处理方法因DNase中所含残留的RNase能破坏RNA完整性而具有很大缺陷。柱式非酶DNA清除剂不但彻底避免了RNase-free DNase的这一缺陷。柱式DNA清除剂为非酶产品，可以常温运输和4℃长期保存；而RNase-freeDNase的运输和长期保存必须在低温进行。

实验要点

1．CTAB溶液在低于15℃时会析出沉淀，因此在将其加入冷冻的植物材料中之前必须预热。

2．在最适条件下，DNA—CTAB沉淀呈白色纤维状，很容易一下子就从溶液中钩出。不过，某些植物种的DNA沉淀中可能含有杂质，特别是多糖，使DNA沉淀呈絮状或胶状，这种情况下可能需要稍事离心才能得到DNA.—CTAB沉淀。

3．饱和酚虽然可有效地使蛋白质变性，但酚不能完全抑制RNA酶的活性,而且酚可以溶解含poLy(A)的mRNA。如果用苯酚和氯仿的混合液，可减轻这两种现象，同时可加入适量的异戊醇（苯酚—氯仿—异戊醇=25:24:1），异戊醇的作用是消泡，并使蛋白质层紧密，使水相和有机相分层较好。

细菌的培养和收集将含有质粒pBS的DH5α菌种接种在LB固体培养基(含50μg/ml Amp)中,37℃培养12-24小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到5ml LB液体培养基(含50μg/ml Amp)中,37℃振荡培养约12小时至对数生长后期。柱式DNA清除剂小量提取法对于从大量转化子中制备少量部分纯化的质粒DNA十分有用。这些方法共同特点是简便、快速，能同时处理大量试样,所得DNA有一定纯度,可满足限制酶切割、电泳分析的需要。

注意事项：

1.对大肠杆菌可从固体培养基上挑取单个菌落直接进行煮沸法提取质粒DNA。

2.煮沸法中添加溶菌酶有一定限度,浓度高时,细菌裂解效果反而不好。有时不同溶菌酶也能溶菌。

3.提取的质粒DNA中会含有RNA,但RNA并不干扰进一步实验,如限制性内切酶消化,亚克隆及连接反应等。

应用^[8][9]

柱式DNA清除剂可用于血液、组织及细菌RNA提取实验中DNA污染的去除：

在苦瓜降血糖多肽-P差异表达方法的建立及其筛选应用实验中需要去除基因组DNA。苦瓜作为一种常见的药食两用的植物,其降血糖活性早已得到广泛的认可并被动物实验和临床实验所证实。苦瓜降血糖成分主要分为皂苷和多肽两大类,其中降血糖多肽P早在20世纪九十年代已进行了分离纯化和药效研究,课题组前期研究中首次获得了降血糖多肽P的基因序列。

本课题主要研究目标为：1在分子水平对不同苦瓜品种的降糖多肽P建立表达差异性研究系统；2根据建立的系统筛选优质的降血糖苦瓜品种。首先,为了获得优质的RNA,以满足后续不同苦瓜品种降血糖多肽-P表达研究,本文通过对RNA抽提方法的优化,获得了不同品种高质量的苦瓜RNA；通过三种去除RNA中DNA残留不同方法的比较,成功地确定了一种高效的去除RNA中微量DNA污染的方法；通过RNA逆转录反应,在不同品种苦瓜中得到了含有多肽P序列的cDNA产物。

其次,利用实时定量PCR,建立筛选优质降血糖苦瓜品种的方法,需要选择合适的苦瓜内参基因。根据葫芦科植物β-actin保守序列设计了引物,用该引物成功获得了一段长为329bp,含88bp内含子结构的苦瓜β-actin基因序列；通过在形态差异较大、地域不同的苦瓜品种进行表达稳定性检测,确定了该基因可作为实时定量PCR研究苦瓜多肽P表达的内参基因；另外,通过NCBI数据库查找,成功地获得了苦瓜18S rRNA基因,并确定了其作为苦瓜内参基因的可能性。

最后,将获得的苦瓜p-actin内参基因引物和多肽P特异性引物进行溶解曲线和标准曲线分析,确保这些引物适合于实时荧光定量PCR的分析。选取八种外观差异明显,产地不同的苦瓜,以β-actin作为内部参比对照,经实时荧光定量PCR分析,确定了具有高表达多肽P的纯丰绿皮和H&V苦瓜品种。

参考文献

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