大提柱式DNA清除剂的应用

背景^[1-7]

大提柱式DNA清除剂可用于细胞总RNA样品中基因组DNA污染的去除。目前最常用的RNase-free DNase处理方法因DNase中所含残留的RNase能破坏RNA完整性而具有很大缺陷。由于血液富含RNase，因此血液RNA非常容易降解，是临床分子生物学研究中的一个棘手的问题。

大提柱式DNA清除剂能快速渗透到新鲜血液细胞内，抑制RNA分子的降解。保存的血液RNA常温可放置3天，4℃可放置5天，-20℃可放置3个月。将大提柱式DNA清除剂与新鲜血液样品按4:1的比例（4份本产品加1份新鲜血液）混合后即可放置。放置结束后将样品转移到离心管中，5000 g室温离心1分钟，小心吸出浅粉红色的上清液，棕红色沉淀（血细胞和蛋白沉淀）直接用于后续的总RNA提取。

大提柱式DNA清除剂特点：

1.处理量大，一次可以处理高达400μg的总RNA。

2.操作简单快速，全部操作只需要十余分钟。

3.回收率高达80%以上。

4.高效，能使总RNA中的基因组DNA污染降低到电泳检测不到的水平，而RNA分子完整性不受任何影响。

5.本身不含RNase污染，避免了用DNase处理的问题。

6.稳定，本产品为非酶产品，可以常温运输和4℃长期保存；而RNase-free DNase的运输和长期保存必须在低温进行。

7.性价比高，单位成本远低于RNase-free DNase。

应用^[7][8]

大提柱式DNA清除剂可用于高纯度RNA提取以及相关研究：

在小鼠胸腺上皮细胞miRNA和mRNA的年龄及性别差异性表达与功能研究中需要提取高纯度的miRNA和mRNA。胸腺作为中枢免疫器官,是T细胞分化、发育和成熟的场所,在机体免疫系统中具有极其重要的作用。随着年龄增长,胸腺逐渐退化,体积变小,初始T细胞输出能力逐渐降低导致机体免疫力下降及免疫衰老。除年龄因素外,胸腺退化还有性别差异,有文献报道,与雄性动物相比,雌性动物的胸腺生长的时间更长,退化的速度更慢。

然而,在胸腺退化过程中究竟是年龄因素还是性别因素占主导作用以及怎样发挥作用,在分子水平层面上的报道并不多。而高通量测序技术使得对一个物种的转录组进行细致全貌的分析成为可能,通过研究1月龄和3月龄雌、雄小鼠miRNA和mRNA调控网络,从分子水平深入揭示年龄和性别差异对胸腺退化的影响,寻找抑制胸腺退化或促进胸腺再生的新方法。

以1月龄雌性小鼠(1F)、1月龄雄性小鼠(1M)、3月龄雌性小鼠(3F)和3月龄雄性小鼠(3M)的胸腺上皮细胞(TECs)为研究对象,采用免疫荧光法、高通量测序、生物信息学分析、RT-qPCR等方法,对小鼠TECs进行鉴定,对小鼠TECs中的差异表达miRNAs和mRNAs进行分析和验证,研究了小鼠胸腺退化过程中这些miRNAs和mRNAs之间的调控关系,并探讨了这些miRNAs和mRNAs对小鼠胸腺退化的年龄和性别差异的影响。

随后,采用CCK-8法、流式细胞术、分子克隆、双荧光素酶报告基因、RNA干扰、RT-qPCR和Western blot等方法,对筛选出的年龄相关性miR-205-5p在小鼠胸腺上皮细胞系(MTEC1)中的生物学功能进行了研究,探讨了miR-205-5p在小鼠胸腺退化过程中的调控机制。

结论:(1)确定了小鼠胸腺上皮细胞miRNAs和mRNAs表达的年龄及性别差异,为以后在分子水平研究胸腺退化提供了数据库。(2)确定了4个差异表达miRNAs(miR-183-5p、miR-199b-5p、miR-200b-3p、miR-205-5p)和3个差异表达基因(Arg1、Cyplb1、Prkcb)可以分别作为不同年龄和不同性别小鼠胸腺发育及退化的分子标记物群。(3)确定了Fa2h是miR-205-5p的靶基因,Fa2h能正反馈调控Tfap2a表达,且Tfap2a和Fa2h促进MTEC1细胞增殖,而miR-205-5p通过靶向调控Fa2h表达抑制MTEC1细胞增殖。

参考文献

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