膜结合DNA清除试剂盒的应用

背景^[1-7]

膜结合DNA清除试剂盒是在无RNase的DNase的基础上开发的、专门用于在柱式法总RNA抽提过程中，清除硅胶膜上基因组DNA污染的产品，

具有下列特点：1.快速，反应条件经过优化，能在5分钟内使硅胶膜上的基因组DNA降解。

2. 不含RNase，可以保证RNA分子完整性不受任何影响。

3. 兼容性广，跟大多数柱式RNA提取试剂盒兼容，可以直接整合进去。不需要在提取到总RNA后再单独去除里面的DNA污染。

4.可以处理各种细菌菌体，包括新鲜菌液或冰冻菌体沉淀。

5.在1.5mL塑料离心管中操作，适用于大规模的快速筛选。

6.采用温和的中性裂解成分，蛋白保持天然活性。

7.产率是5-10 mg蛋白质/mL细菌。

8.无须昂贵设备，无需溶菌酶、超声波破碎等复杂的操作步骤，离心分离即可得到，简单便捷。

9.得到的提取物可以直接用于SDS-PAGE、2D电泳、免疫印迹分析、蛋白活性测定和BCA法及Lowry法蛋白定量（不适用于Bradford法）。硅基质吸附材料原理为在高盐环境下质粒DNA能够结合到硅基质上，然后用低盐缓冲液或水将质粒DNA从硅基质上洗脱下来。得到的质粒可以用于酶切、PCR、测序、细菌转化、转染等分子生物学实验。

应用^[8][9]

膜结合DNA清除试剂盒DNA主要包括植物、动物、微生物基因组DNA的提取与鉴定，哺乳动物组织总RNA的提取与鉴定，质粒DNA的提取与鉴定，扩增，分子杂交技术，限制性内切酶消化，分子克隆全过程和基因文库的构建等实验项目中的DNA。抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)也称为肽类抗生素(Peptideantibiotics)或天然抗生素(Natural antibiotics),是一类对细菌、真菌等微生物及某些昆虫和动植物细胞具有抑制作用的小分子多肽。研究抗菌肽为开发新的抗菌素、抗病毒和肿瘤抑制剂开辟了广阔的前景。

本实验的目的旨在从银杏果仁中分离纯化出一种抗菌肽、对其性质进行研究,并建立从银杏种仁中反转录克隆cDNA的方法体系,为克隆基因和研究其抗菌机理奠定基础。本实验以银杏种仁为研究材料,以常压柱层析法、离心式离子交换层析加电洗法脱、AKTA柱层析法等三种方法从银杏种仁中提取出一种抗菌肽,并对其纯度、分子量、抗菌活性、热稳定性、对极端pH值的抗性、对高盐浓度的抗性等性质进行了分析。通过异硫氰酸胍法、TRIzoL法,CTAB法以及SDS法分别提取银杏种仁的总RNA,建立反转录体系。

主要获得以下结果:

1、三种方法纯化出银杏种仁抗菌肽,此蛋白在SDS-PAGE上显示单条带,表观分子量为13000Da。AKTA柱层析法所得蛋白在双向电泳中达到单点纯。

2、该蛋白在离子交换层析中以高盐浓度被洗脱,是一种碱性蛋白。对照其双向电泳图谱,其等电点在9.8左右。

3、纯化的蛋白对黄瓜镰刀孢菌(Fusarium oxysporum)辣、椒早疫病菌(Alternariasolani)、小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、葡萄灰霉病菌(Botrytis cinereaPers)、黄瓜炭疽病菌(Colletotrichum lagenarium)等14种真菌有抑制作用。

4、该蛋白浓度达到2.5mg/ml以上即表现出明显的抑菌活性。具有较高热稳定性,在90℃处理30min对黄瓜镰刀孢菌抑菌活性无明显变化。在酸性条件下,对供试的黄瓜镰刀孢菌有很强的抑菌活性。对革兰氏阳性菌代表菌金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性菌代表菌大肠杆菌均有一定的抑制作用。

5、CTAB法提取得总RNA纯度高,完整性好,可用于反转录试验。

参考文献

[1]Antifungal proteins:targets,mechanisms and prospective applications[J].T.Theis,U.Stahl.Cellular and Molecular Life Sciences.2004(4)

[2]A novel procedure for separating small peptides on polyacrylamide gels[J].Kwabena Sarfo,Greg B.G.Moorhead,Raymond J.Turner.Letters in Peptide Science.2003(2)

[3]A method for isolating total RNA from pear leaves[J].M.Malnoy,J.P.Reynoird,F.Mourgues,E.Chevreau,P.Simoneau.Plant Molecular Biology Reporter.2001(1)

[4]A simple and efficient protocol for isolation of functional RNA from plant tissues rich in secondary metabolites[J].Evi Kiefer,Werner Heller,Dieter Ernst.Plant Molecular Biology Reporter.2000(1)

[5]A simple procedure for the isolation of high quality RNA from ripening banana fruit[J].Mehar H.Asif,Puneet Dhawan,Pravendra Nath.Plant Molecular Biology Reporter.2000(2)

[6]Characterization and cDNA cloning of two glycine-and histidine-rich antimicrobial peptides from the roots of shepherd’s purse,Capsella bursa-pastoris[J].Chong Jing Park,Chan Bae Park,Seung-Suh Hong,Hyun-Soo Lee,Sang Yeol Lee,Sun Chang Kim.Plant Molecular Biology.2000(2)

[7]An Improved RNA Isolation Method for Plant Tissues Containing High Levels of Phenolic Compounds or Carbohydrates[J].R.A.Salzman,T.Fujita,K.Zhu-Salzman,P.M.Hasegawa,R.A.Bressan.Plant Molecular Biology Reporter.1999(1)

[8]A Method for Isolation of Total RNA from Fruit Tissues of Banana[J].Jun-Jun Liu,Chong-Jin Goh,Chiang-Shiong Loh,Pei Liu,Eng-Chong Pua.Plant Molecular Biology Reporter.1998(1)

[9]荆贝贝. 银杏种仁抗菌肽的分离纯化、性质鉴定及其总RNA提取[D].西北农林科技大学,2006.