动物细胞基因组DNA提取试剂盒

背景^[1-6]

动物细胞基因组DNA提取试剂盒采用可以特异性结合DNA的离心吸附柱和独特的缓冲液系统，提取组织和细胞的基因组DNA。离心吸附柱中采用的硅基质材料为本公司特有新型材料，能够高效、专一吸附DNA，可限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物。提取的基因组DNA片段大，纯度高，质量稳定可靠。使用本试剂盒提取的基因组DNA可用于各种常规操作，包括酶切、PCR、文库构建、Southern杂交等实验。

操作步骤：

使用前请先在漂洗液中加入无水乙醇，加入休积请参照瓶体上的标签。所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。

1、样品的处理：

a、细胞：取1×106-1×107个悬浮培养细胞，12000rpm离心1min收集细胞，贴壁细胞先用胰蛋白酶消化处理，再用预冷的PBS吹打成细胞悬液，然后12000rpm离心1min收集细胞，尽量除去上清，加200ul溶液A，振荡至彻底混匀。

b、组织：组织量不宜过大，一般不要超过25mg，可以使用匀浆器匀浆，用液氮研磨成粉末状，再用预冷的PBS或无菌水充分悬浮，然后12000rpm离心1min收集细胞，尽量除去上清，加200ul溶液A，振荡至彻底混匀。

2、向悬浮液中加入20ul的RNase A(10mg/ml)，55℃放置15min。

3、加入20ul的蛋白酶K(10mg/ml)，充分颠倒混匀，55℃水浴消化，细胞消化时间较短，组织消化时间较长，一般需要1-3个小时才能完成（鼠尾需要消化过夜）。消化期间可颠倒离心管混匀数次，直至样品消化完全为止。消化完全的指标是：液体清亮及粘稠。

4、加入200ul体积溶液B，充分颠倒混匀，如出现白色沉淀，可放置于75℃15-30min，沉淀即会消失，不影响后续实验。如溶液未变清亮，说明样品消化不彻底，可能导致提取的DNA量少及不纯，还有可能导致堵塞吸附柱。

5、加入200ul无水乙醇，充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀，不影响DNA的提取，可将溶液和絮状沉淀都加入吸附柱中。

6、12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。

7、向吸附柱中加入600ul漂洗液(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。

8、向吸附柱中加入600ul漂洗液，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。

9、12000rpm离心2min，将吸附柱敞口置于室温或50℃温箱放置数分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，否则漂洗液中的乙醇会影响后续的实验如酶切、PCR等。

10、将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加50-200ul经65℃水浴预热的洗脱液，室温放置5min，12000rpm离心2min。

11、可将离心所得洗脱液再加入吸附柱中，12000rpm离心2min，即可得到高质量的基因组DNA。

注意事项:

1、试剂盒拆封后，RNase A和蛋白酶K需放置-20℃保存。

2、样品应避免反复冻融，否则会导致提取的DNA片段较小且提取量也下降。

3、如果试剂盒中的溶液出现沉淀，可在65℃水浴中重新溶解后再使用，不影响效果。

4、洗脱缓冲液的体积不少于50ul，体积过小会影响回收效率：洗脱液的pH值对洗脱效率也有影响，若需要用水做洗脱液应保证其pH值在8.0左右(可用NaOH将水的pH值调至此范围)，pH值低于7.0会降低洗脱效率。

应用^[7][8]

动物细胞基因组DNA提取试剂盒可用于动物组织及悬浮细胞基因组DNA提取：

在封闭群动物DNA多态性检测方法的建立及应用实验中应用筛选获得的封闭群豚鼠多态性微卫星标记,建立了适用于封闭群豚鼠遗传质量检测的微卫星标记检测方法,并应用该方法对2个豚鼠群体进行遗传质量检测;同时,应用筛选获得的封闭群兔SNP位点,建立了适用于封闭群兔遗传质量检测的SNP遗传检测方法,并用该方法分析了3个封闭群兔的遗传多样性。

为实验动物的遗传质量控制提供新的遗传检测手段。闭群豚鼠微卫星标记检测方法的建立及初步应用首先,通过比较新鲜抗凝血Na I手提法、血凝块手提法和试剂盒DNA提取法三种血液基因组DNA提取方法,为后续实验提供简便、快捷的DNA提取方法。其次,根据相关文献挑选出40个富含多态性的豚鼠微卫星位点,经过PCR条件优化、3%琼脂糖凝胶电泳和STR扫描筛选共获得25个扩增条带清晰、多态性高的微卫星位点。

再有,采用筛选出的25个多态性微卫星位点,建立封闭群豚鼠微卫星标记遗传质量检测方法,对A、B两个封闭群豚鼠进行遗传质量检测,并计算其群体遗传学参数,包括平均观测等位基因数、平均期望杂合度、平均多态信息含量等,然后进行了Hardy-Weinberg平衡(HWE)检验和杂合子缺失检验。

参考文献

[1]Single nucleotide polymorphisms in the FTO gene and their association with growth and meat quality traits in rabbits[J].Gong-Wei Zhang,Lian Gao,Shi-Yi Chen,Xiao-Bing Zhao,Yao-Fu Tian,Xia Wang,Xiao-Song Deng,Song-Jia Lai.Gene.2013

[2]Identification of Enterohemorrhagic Escherichia coli O157‐Specific DNA Sequence Obtained from Amplified Fragment Length Polymorphism Analysis[J].Akihiko Tokunaga,Masanori Kawano,Masatoshi Okura,Sunao Iyoda,Haruo Watanabe,Ro Osawa.Microbiology and Immunology.2007(9)

[3]High levels of nucleotide diversity in the European rabbit(Oryctolagus cuniculus)SRY gene[J].A.Geraldes,C.Rogel‐Gaillard,N.Ferrand.Animal Genetics.2005(4)

[4]Impact of genetic profiles on experimental studies:outbred versus wild rats[J].Toxicology and Applied Pharmacology.2003(1)

[5]Development of a SNP genotyping panel for genetic monitoring of the laboratory mouse[J].Petko M.Petkov,Megan A.Cassell,Evelyn E.Sargent,Charles J.Donnelly,Phil Robinson,Victor Crew,Steven Asquith,Raymond Vonder Haar,Michael V.Wiles.Genomics.2003(5)

[6]Cloning,pharmacological characterization,and polymorphism screening of the guinea pigβ2-adrenoceptor[J].Jaap Oostendorp,Herman Meurs,S Adriaan Nelemans,Johan Zaagsma,Henk F Kauffman,Dirkje S Postma,Hendrikus W.G.M Boddeke,Knut Biber.European Journal of Pharmacology.2002(1)

[7]The essence of SNPs[J].Anthony J.Brookes.Gene.1999(2)

[8]李芳芳.豚鼠和家兔封闭群动物DNA多态性检测方法的建立及应用[D].中国食品药品检定研究院,2015.