无血清细胞冻存液的使用方法

无血清细胞冻存液，含有5%的二甲基亚砜（DMSO），对细胞的毒性较低；不含动物来源性蛋白或血清，配方成分明确，不仅适用于常规细胞系、原代细胞，同时亦适合于无血清培养细胞和蛋白表达细胞。

使用方法

（一） 细胞冻存

1. 取对数生长期的细胞，去除旧培养液，加入 PBS 清洗细胞；

2. 去除 PBS，加入适量胰蛋白酶（覆盖培养皿表面） 室温孵育 2~3 min，把单层生长细胞消化下来；

3. 加入双倍体积的完全培养基或胰酶终止剂终止细胞消化（如果冻存细胞为悬浮细胞按照步骤 4-8 进行操作）；

4. 将消化后的细胞悬液或者悬浮细胞液转移至离心管中，进行细胞计数；

5. 室温 1000 rpm 离心 5 min；弃掉上清液；

6. 加入适量 4℃预冷的无血清细胞冻存液重悬细胞沉淀，制成细胞悬液（按照细胞密度和所用细胞冻存管的尺寸计算所需冻存液的量，推荐冻存密度：5x105 至 1x107cells/mL；

7. 将细胞分装入冻存管中，每管 1～1.5 ml； 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者等信息；

8. 针对常规肿瘤细胞：将冻存液重悬后的细胞直接放入-80℃冰箱，过夜后转入至液氮罐中 长期保存。针对难养或珍贵细胞：将冻存液重悬后的细胞放入程序降温盒，或者程序降温后再放入-80℃冰箱，过夜后转入至液氮罐中长期保存。

（二） 细胞复苏

1. 将水浴锅温度调至 37℃，取出冻存管快速置于水浴锅内，晃动冻存管直至管中冻存细胞融化成液体；

2. 将溶解的细胞冻存悬液转移至含有 5-10 倍体积完全培养基的离心管中，待冻存管中细胞完全融化后，将冻存细胞悬液缓慢加入离心管中，轻轻混匀；

3. 室温 1000 rpm 离心 5 min； 去除上清液，加入已回温的完全培养基重悬细胞，进行细胞计数，根据计数结果，取适量的细胞悬液接种到新的培养瓶内；

4. 将培养瓶转移至 37℃，5% CO2 培养箱中，按常规方法培养。