土壤基因组DNA提取试剂盒

背景^[1-6]

土壤基因组DNA提取试剂盒通过Buffer SCL裂解释放出基因组DNA，Buffer SP低温沉淀蛋白等杂质，再通过氯仿进一步纯化。但获得的土壤基因组中可能含有腐殖酸，可与的土壤腐殖酸清除剂（DT81714）联合使用，去除土壤中的腐殖酸，避免腐殖酸对后续实验的干扰。试剂盒可从200 mg土壤中可以获得5~15μg DNA，OD260/OD280比值一般在1.7~1.9之间。抽提出的DNA可用于酶切、PCR、文库构建、Southern Blot等相关实验。

标准操作步骤：

如非指出，所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。

1.称0.3-0.5 g土壤置于2ml离心管中，加入0.4 g Glass Beads，再加入700μl缓冲液R1与100μl缓冲液R2。涡旋器高速震荡3-5min。

注意：对含水量丰富的样品，可以预先离心除去部分水分后再称取样品。缓冲液R2是腐殖酸去除剂，100μl对大部分样品来说足以有效除去腐殖酸等抑制因子。对一些腐殖酸含量特别丰富的土壤，缓冲液R2的量可以适当增加，但不能超过250μl，否则会严重影响DNA的得率。

2.加入100μl缓冲液R3（R3如有沉淀37℃水浴完全溶解后再用），涡旋混匀。70℃水浴处理10min。期间振荡几次。

3.12000 rpm(~13,000g)离心1分钟，取600μl上清到1.5ml离心管中，加入180μl缓冲液R4混匀。

4.冰上放置5分钟。12000 rpm(~13,000g)离心1分钟。转移上清到新的1.5ml离心管中。

5.加入与上清等体积的缓冲液R5（使用前请检查是否已加入异丙醇），颠倒混匀。

6.取750μl混合液加到吸附柱中（吸附柱放入收集管中），12000 rpm(~13,000g)离心30秒，倒掉滤出液。

7.将剩余的混合液加到吸附柱中（吸附柱放入收集管中），12000rpm(~13,000g)离心30秒，倒掉滤过液。

8.向吸附柱CG中加入500μl漂洗缓冲液WB1，12,000 rpm(~13,000×g)离心30秒，倒掉废液。

9.向吸附柱CG中加入600μl漂洗缓冲液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000 rpm(~13,000g)离心30秒，倒掉废液，吸附柱CG放入收集管中。

10.向吸附柱CG中加入600μl漂洗缓冲液PW，12,000 rpm(~13,000g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CG放入收集管中。

11.12,000 rpm(~13,000g)离心2分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

12.将吸附柱CG转入一个干净的1.5ml离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50–100μl经70℃水浴预热的洗脱缓冲液EB，室温放置2分钟，12,000 rpm(~13,000g)离心2分钟。

13.DNA产物-20℃保存。

DNA浓度及纯度检测：

基因组DNA片段的大小与样品保存时间、操作过程中的剪切力等因素有关。提取的DNA片段可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。可配制0.8-1.0％琼脂糖凝胶，使用λ/HindIII判断基因组的大小，完整的基因组大小应在23kb以上。

使用分光光度计检测时，OD260/OD280比值应为1.7–1.9之间，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用去离子水洗脱，比值可能偏低，但并不表明DNA纯度不高。

应用^[7][8]

土壤基因组DNA提取试剂盒可用于土壤基因组DNA提取：

建立了两种从湿地土壤中提取微生物总DNA的方法,即氯化钙-SDS-酶法(新方法1)和玻璃珠-氯化钙-SDS法(新方法2)。在直接提取DNA过程中采用氯化钙去除腐殖酸,DNA提取缓冲液中不使用EDTA螯合剂,提取过程用时分别为4 h左右和2 h。氯化钙-SDS-酶法与中科院土壤DNA提取法以及国产试剂盒两种方法相比,可高效去除湿地土壤腐殖酸,纯度较高,满足16S rDNA的PCR扩增,为微生物生态学研究提供了一种高效的湿地土壤微生物总DNA提取和纯化技术。但

方法1应用于微生物功能基因的研究受到限制,基于以上原因,我们对氯化钙-SDS-酶法进行改进。依据微生物不均匀地分布在微团聚体内部以及微团聚体外部的孔隙中并通过不同的结合机制紧密地结合到土壤颗粒上以及氨氧化细菌(AOB)具有依附性的特点,通过玻璃珠分散土壤颗粒内部和表面结合的细胞,最终获得一种适用于氨氧化细菌(AOB)和氨氧化古菌(AOA)amoA基因片段PCR扩增的快速DNA提取方法,即玻璃珠-氯化钙-SDS法,与氯化钙-SDS-酶法和UltraCleanTM Soil DNA Isolation Kit试剂盒进行比较,对16S rDNA、AOB和AOA中amoA基因片段进行PCR扩增。

参考文献

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[8]李靖宇.草原湿地土壤总DNA提取方法及其在氨氧化微生物研究中的应用[D].内蒙古大学,2011.