GV3101 Electro感受态细胞的应用

背景^[1-6]

GV3101 Electro感受态细是以C58型背景，核基因中含有筛选标签——利福平抗性基因rif，为了便于转化操作，此菌株携带一无自身转运功能的胭脂碱型Ti质粒pMP90(pTiC58DT-DNA)，此质粒含有vir基因(vir基因是T-DNA插入植物基因组必需的元件，pMP90(pTiC58DT-DNA)质粒自身的T-DNA转移功能被破坏，但可以帮助转入的双元载体T-DNA顺利转移)。

pMP90(pTiC58DT-DNA)型Ti质粒含有筛选标签：gent，赋予GV3101菌株庆大霉素抗性；在GV3101菌株中转入help质粒：pSoup-p19即为GV3101(pSoup-p19)菌株，可帮助pGreen，62SK，pGs2等质粒在农杆菌中复制，同时赋予该菌株四环素（tet）抗性。适用于拟南芥、烟草、玉米、土豆等植物的转基因操作。唯地生物开发的GV3101(pSoup-p19)电转感受态特别适用于大质粒的转化：经pGs2(卡那霉素抗性)质粒检测转化效率>105 cfu/μg DNA；经pGs2-ZH(卡那霉素抗性)质粒(size:40 kd)检测转化效率可达5×103 cfu/μg DNA。

GV3101 Electro感受态细胞操作方法：

1.0.1 cm电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟，待其沥干水分，正置5分钟，使乙醇充分挥发，待乙醇挥发干净立即插入冰中，压实冰面，电极杯顶离冰面0.5 cm以方便盖上杯盖，冰中静置5分钟充分降温。

2.取-80℃保存的农杆菌感受态插入冰中5分钟，待其融化，加入0.01-1μg质粒DNA（体积不大于6ul，感受态转化效率较高，次使用前做预实验确定所加质粒的量），用手拨打管底混匀，立即插入冰中，用200μl枪头将感受态-质粒混合物快速移到电击杯中，盖上杯盖，空管保留待用。

3.启动电转仪，设置参数：C=25μF，PC=200 ohm，V=2400 V（此参数为Biorad推荐，使用者也可按所用电转仪推荐的protocol操作），将电击杯快速放入电转槽中，电击完成快速插入冰中，加入700μl无抗生素的LB并转移到感受态空管中，28℃振荡培养2~3小时。

4.6000 rpm离心一分钟收菌，留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培养箱培养2-3天

应用^[7][8]

GV3101 Electro感受态细胞可用于基因克隆及蛋白表达研究：

根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)是一种植物致病菌,能感染绝大多数双子叶植物与少数单子叶植物。农杆菌将自身携带的Ti质粒上的T-DNA(transferred DNA)单链拷贝分子—ssT-DNA,即T-strand,整合至植物细胞基因组中,T-DNA上原癌基因的表达使植物产生冠瘿瘤。在T-strand的运输过程中,农杆菌也同时将自身合成的毒性蛋白分泌至植物细胞,帮助T-strand从植物细胞质运送至细胞核,并参与其整合过程。

为了了解农杆菌侵染对拟南芥基因转录的影响,揭示拟南芥细胞对农杆菌毒性蛋白与原癌基因表达反应的机制,以及研究农杆菌毒性蛋白的应用。用打离差方法重新分析Deeken等人(2006)和Lee等人(2009)的基因芯片数据,比较拟南芥受伤花梗接种农杆菌GV3101后第6天与第3小时以及冠瘿瘤成熟期与幼龄期的光合作用、呼吸作用、胁迫反应、激素代谢、核苷酸、RNA、DNA、蛋白质、脂类代谢和信号传导等代谢途径相关基因的转录变化差异,并且表达农杆菌VirD2和VirE2蛋白。

成熟期冠瘿瘤细胞的信号途径的基因转录受到一定程度的抑制幼龄期冠瘿瘤细胞中有59信号途径相关基因发生差异转录,当中40个转录增强,19个转录减弱。而成熟期有185个信号途径相关基因的转录发生改变,其中101个转录增强,84个转录减弱。G蛋白编码基因的转录变化差异明显。幼龄期冠瘿瘤细胞中有14个G蛋白编码基因发生差异转录,只有1个的转录是下降的,其它13个全部上升。

而成熟期有30个G蛋白编码基因的转录发生变化,其中水平下调的多达14个基因,表明某些信号途径受到一定程度的抑制。VirD2和VirE2蛋白的表达本研究从农杆菌C58和LBA4404基因组中分别克隆了vird2和vire2基因,并构建了克隆载体pCVD2和pCVE2。通过亚克隆分别构建了表达载体pEVD2和pEVE2,并表达和纯化了VirD2和VirE2融合蛋白,对VirD2体外单独切割ssT-DNA和质粒T-DNA做了尝试。

参考文献

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