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Necrostatin-1(TNF-alpha抑制剂)

发布日期:2019/5/22 10:52:16

背景[1-6]

Necrostatin-1(TNF-alpha抑制剂)是一种有效,选择性和可渗透细胞的坏死性凋亡(necroptosis)抑制剂,在Jurkat细胞中的EC50为490 nM。它通过抑制坏死性凋亡途径中的死亡域受体激酶RIP(RIP1)起作用。Necrostatin-1(1-100μM)抑制过表达和内源性的RIP1发生自磷酸化。RIP1是初级细胞靶点,负责Necrostatin-1的抗细胞坏死活性。Necrostatin-1有效抑制多种类型细胞触发的坏死性细胞死亡。

Necrostatin-1作为细胞坏死的小分子抑制剂,作用于jurkat细胞,抑制RIP激酶的诱导细胞坏死,抑制TNF-α诱导的细胞坏死,EC50为490 nM。传统意义上,细胞死亡分为调控型(凋亡,apoptosis)和非调控型(坏死,necrosis)两种。越来越多的研究发现坏死也可以受调控,即一种新型的细胞死亡机制,称为坏死性凋亡(necroptosis)。凋亡,也称为程序性细胞死亡(PCD)或自杀性细胞死亡,被认为是一种基因控制、高度有序的细胞自主死亡,由一系列信号事件组成的通路。

细胞在一定的生理或病理状态下,遵循自身的程序,自己结束自己生命的过程,最后细胞脱落离体或裂解为若干凋亡小体,并迅速被周围专职或非专职吞噬细胞吞噬,不会导致炎症反应。坏死或坏死性细胞死亡,是由非特异性和非生理压力诱导产生的一种偶然且非调控、被动的细胞死亡。由于缺乏普通的生化共因,坏死大体仍被归类为消极因素,没有凋亡或自吞噬标志物。

现今,坏死的形态学特征有:细胞容积增大(胀亡)、细胞器膨胀、质膜破损和随后一系列的细胞内含物流失。坏死性凋亡,一种受调控发生的坏死,具有以下特征:1)具有坏死样表征的细胞死亡有助于维持胚胎发育和成年组织内环境稳态;2)坏死样细胞死亡可以通过配体结合到其特异性膜受体而被诱导产生;3)坏死可以被遗传、表观遗传以及药理学因素来调控;4)caspase的失活可使凋亡转变为具有凋亡样和坏死样混合特征的细胞死亡或完全性坏死。坏死性凋亡的发生取决于RIP1(受体相互蛋白1)的丝氨酸/苏氨酸激酶活性,可通过RIP1活性抑制而被阻断。

越来越多的研究表示,坏死性凋亡是一种重要的细胞死亡机制,在脑缺血、心急缺血、急性和慢性神经退行性疾病、肿瘤等多种人类病理活动中具重要作用。Necrostatin-1(Nec-1),一种特异性且强效的坏死性凋亡(necroptosis)抑制剂,区别于自发凋亡(apoptosis)的一种程序性死亡机制,不会对Fas/TNFR激发的经典自发凋亡级联反应产生任何干扰。Nec-1是一种ATP竞争性的受体相互作用蛋白激酶1(receptor-interacting protein kinase 1,RIPK1,RIP1 kinase)变构抑制剂(EC50=180 nM),该蛋白是参与坏死性凋亡激活途径至关重要的一种上游激酶。小鼠的中风模型中,Nec-1能够降低再灌注引起的脑损伤。

应用[7][8]

Necrostatin-1(TNF-alpha抑制剂)可用于细胞死亡机制研究:

necrostatin-1与受体相互作用蛋白激酶1(receptorinteraction protein kinase1,RIP1)及受体相互作用蛋白激酶3(receptor interactionprotein kinase3,RIP3)在谷氨酸诱导的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)与海马神经元(HT22)毒性中发挥的作用。用谷氨酸或TNF-诱导后,检测野生型及RIP3缺失型小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)以及HT22细胞的存活率,以探明它们对谷氨酸或TNF-的敏感度。

通过siRNA干扰将TNF-诱导的坏死通路中的关键蛋白RIP1沉默,或通过药物necrostatin-1预处理,后加入谷氨酸或TNF-诱导,观察RIP1的下调与necrostatin-1预处理对谷氨酸或TNF-诱导的细胞死亡的影响是否一致。并用western blot检测其siRNA的干扰效率。利用RIP3缺失的MEF细胞,以及通过用siRNA干扰降低RIP3表达的HT22细胞,检测RIP3的缺失或下调对谷氨酸或TNF-诱导的细胞死亡的影响,以判断TNF-诱导坏死的关键蛋白RIP3是否参与谷氨酸诱导的细胞死亡信号通路。

通过siRNA干扰的方法下调线粒体蛋白凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor,AIF)的表达,以判断AIF在谷氨酸或TNF-诱导的细胞死亡中的作用;通过使用自噬及溶酶体的化学抑制剂balfilomycin-A1(BFA),Chloroquine(CQ),3-Methyladenine(3-MA)以及活性氧ROS的化学抑制剂butylated hydroxyanisole(BHA),N-acetylcysteine(NAC)以判断谷氨酸或TNF-诱导的细胞死亡与自噬或溶酶体及活性氧的关系。

参考文献

[1]Aralar mRNA and protein levels in neurons and astrocytes freshly isolated from young and adult mouse brain and in maturing cultured astrocytes[J].Baoman Li,Leif Hertz,Liang Peng.Neurochemistry International.2012(8)

[2]Mixed Lineage Kinase Domain-like Protein Mediates Necrosis Signaling Downstream of RIP3 Kinase[J].Liming Sun,Huayi Wang,Zhigao Wang,Sudan He,She Chen,Daohong Liao,Lai Wang,Jiacong Yan,Weilong Liu,Xiaoguang Lei,Xiaodong Wang.Cell.2012(1)

[3]Kainate receptors coming of age:milestones of two decades of research[J].Anis Contractor,Christophe Mulle,Geoffrey T.Swanson.Trends in Neurosciences.2011(3)

[4]Mood Disorders Are Glial Disorders:Evidence from In Vivo Studies[J].Matthias L.Schroeter,Hashim Abdul-Khaliq,Julia Sacher,Johann Steiner,Ingolf E.Blasig,Karsten Mueller,Claus W.Heizmann.Cardiovascular Psychiatry and Neurology.2010

[5]Phosphorylation-Driven Assembly of the RIP1-RIP3 Complex Regulates Programmed Necrosis and Virus-Induced Inflammation[J].YoungSik Cho,Sreerupa Challa,David Moquin,Ryan Genga,Tathagat Dutta Ray,Melissa Guildford,Francis Ka-Ming Chan.Cell.2009(6)

[6]Receptor Interacting Protein Kinase-3 Determines Cellular Necrotic Response to TNF-α[J].Sudan He,Lai Wang,Lin Miao,Tao Wang,Fenghe Du,Liping Zhao,Xiaodong Wang.Cell.2009(6)

[7]Time-dependent reduction of glutamine synthetase in retina of diabetic rats[J].Yu Xu-hui,Zhang Hong,Wang Yu-hong,Liu Li-juan,Teng Yan,Liu Ping.Experimental Eye Research.2009(6)

[8]]徐雷. Necrostatin-1保护谷氨酸诱导的细胞死亡机制研究[D].苏州大学,2014.