Protein A+G Agarose

背景^[1-6]

Protein A+G Agarose(Fast Flow,进口分装)是一种优质的抗体纯化亲和树脂。Pierce Protein A/G琼脂糖由纯化的蛋白A/G重组融合蛋白组成，其已经共价固定在高质量交联的6％珠状琼脂糖（CL-6B）上。这种特殊种类的树脂提供了最通用的色谱特征组合，用于从哺乳动物血清样品中高纯度纯化全IgG。琼脂糖珠具有适用于许多亲和纯化系统的物理和化学性质。蛋白A/G是遗传工程蛋白，其结合蛋白A和蛋白G的IgG结合结构域。

融合蛋白在大肠杆菌中表达。蛋白A/G含有来自蛋白A的四个Fc结合结构域和来自蛋白G的两个Fc结合结构域，导致最终质量为50,460道尔顿（通过SDS-PAGE为40至45kDa）。蛋白A/G不像单独的蛋白A那样依赖于pH，但是具有蛋白A和G的添加特性。

蛋白A/G与所有人IgG亚类结合，使其成为纯化未确定亚类同一性的多克隆或单克隆IgG抗体的理想选择。此外，它与IgA，IgE，IgM和（在较小程度上）IgD结合。蛋白A/G也与所有小鼠IgG亚类良好结合，但不结合小鼠IgA，IgM或血清白蛋白。这使得蛋白A/G成为纯化和检测IgG亚类小鼠单克隆抗体的优秀工具，不受IgA，IgM和鼠血清白蛋白的干扰。

小鼠单克隆的单个亚类可能对嵌合蛋白A/G具有比对蛋白A或蛋白G更强的亲和力。Pierce Protein A/G Agarose使用Thermo Scientific AminoLink Coupling Chemistry制备，与传统的配体固定方法相比，它具有多种优势。AminoLink固定化通过简单的酰胺键导致琼脂糖珠的糖单体和蛋白A上的天然赖氨酸残基之间的缀合。与典型的溴化氰（CNBr）固定不同，AminoLink方法不会引入任何新的化学基团，这些化学基团可能导致不希望的非特异性结合并产生稳定的，基本上不可逆的键。结果是高结合能力的树脂，其通过多轮抗体纯化保留功能性固定的蛋白A/G。

Pierce Protein A/G Agarose几乎可以从血清，腹水，细胞培养上清液和其他抗体样品中结合所有同种型和哺乳动物IgG，从而实现有效的抗体纯化。因为固定的蛋白A/G结合了蛋白A和蛋白G的免疫球蛋白结合结构域，所以该树脂对于来自广泛哺乳动物宿主物种的IgG抗体的亲和纯化是有效的。

应用^[7][8]

主要用于免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP)或免疫共沉淀(Co-IP)，也可以用于抗体的纯化。Protein A+G Agarose也适合于免疫沉淀所有Protein A Agarose和Protein G Agarose单独可以免疫沉淀的抗体，包括mouse IgG1,IgG2a,IgG2b,IgG3,IgA,rat IgG1,IgG2a,IgG2b,IgG2c,rabbit IgG,rabbit and goat polyclonal Abs，以及human IgG1,IgG2,IgG3和IgG4。

肝细胞核因子HNF3β是一类在肝脏中富集表达的转录因子,调控多种肝脏基因的组织特异性表达,参与维持肝脏正常的表型与生理功能。敲除HNF3β的小鼠不能形成正常的神经脊索并早期胚胎致死,HNF3β的变异可能与2型糖尿病的发生相关。HNF3β参与糖代谢、脂肪代谢、调控胆酸以及生长相关基因的表达调控。HNF3β在调控基因转录的过程中需要募集多种辅助因子协同发挥作用。

对HNF3β相互作用蛋白质的挖掘研究,有助于更深入的探索HNF3β在生命过程中的功能及作用机制。目前有关HNF3β蛋白质间相互作用的报道还相对较少,已知的与HNF3β发挥相互作用的蛋白质只有8个,包括OTX2,SRC1,TLE1,HOXA5,HNF6A,GSC,EN2,LHX1等,它们都参与转录调控。这些数据对于全面的阐明HNF3β蛋白复合体的组成及动态变化还是远远不够的。目前大规模研究蛋白质间相互作用的方法主要有酵母双杂交技术,但由于要去除转录激活区,因此并不适用于研究转录因子。

免疫共沉淀技术可用于研究生理水平下蛋白质间的相互作用,随着质谱技术的发展,其准确性高与速度快的优点使免疫共沉淀联合质谱分析技术已被广泛应用于寻找生理水平下新的相互作用。对HNF3β相互作用蛋白质进行了分离鉴定,并对LMNA-HNF3β相互作用介导的生物学功能进行了初步的研究。以HNF3β特异抗体免疫沉淀分离HepG2细胞内HNF3β蛋白质复合体,SDS-PAGE电泳、考马斯亮蓝染色,切取与对照组存在差异的条带进行SDS-PAGE胶上蛋白质LTQ质谱鉴定其组成成分。

参考文献

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