SART3抗体的应用

背景^[1-3]

SART3抗体是一种可以特异性结合SART3的人工合成抗体，可以靶向结合人、小鼠、大鼠和猪样品中的SART3蛋白。SART3抗体可用于多种科学应用，包括Western Blot、免疫组织化学、免疫细胞化学、免疫沉淀和ELISA。

SART3是肌钙蛋白复合物的抑制亚基，其作用是抑制肌球蛋白ATP酶活性。SART3基因位于染色体19p1上，由8个外显子组成，编码210个氨基酸，5%左右的HCM是由这些突变所致，大部分为错义突变或缺失突变。TNNI3突变表现为混合型、形态学特征不明显的心肌病，国外研究发现TNNI3的第186位氨基酸由精氨酸变为甘氨酸，这种突变使两个家族成员表现出肥厚性心肌病和左心室非致密化不全的混合形态特征。而这两种类型的心肌病均不明显，两个家庭成员中有4位在30岁之前猝死，提示该基因突变预后较差。对13例家系的HCM患者进行SART3基因筛查，首次在国内发现SART3基因第157位氨基酸由丙氨酸变为缬氨酸，携带该突变的家系的患者晚期有心肌变薄、心腔扩张的趋势。

SART3抗体

SART3抗体使用步骤（Western Blot）：

1.样本制备

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-细胞/组织裂解液缓冲液），混匀。

2）贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g离心3-5min，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白电泳

1）取出预制胶，将预制胶固定在电泳槽中，内槽加满tris-glycine电泳缓冲液。

2）在室温或不超过37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上样缓冲液。水浴溶解后立即室温存放。

3）混合蛋白样品和5XSDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

4）100℃或沸水浴加热3-5min，以充分变性蛋白，之后冷却至室温备用。

5）上样蛋白，并在1个孔中上样蛋白marker，盖上电泳槽盖，打开电源，电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。

6）电泳后取出胶板，用刀在侧边硅胶处，沿着两片玻璃缝隙切开硅胶，即可打开玻璃板；取胶时。

3.转膜与封闭

1）将胶浸于预冷的转膜缓冲液中平衡5min。

2）依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入预冷的转膜缓冲液中平衡10min，如用PVDF膜，需参照说明书，先用纯甲醇浸泡1-2min，再孵育于预冷的转膜缓冲液中。

3）装配转移三明治：海绵/3层滤纸/胶/膜/3层滤纸/海绵，每层放好后，用试管赶尽气泡。

4）将转移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近阳极，胶靠近阴极，加入转移缓冲液，插上电极，100V，1h（电流约为0.3A）。

5）转膜结束后，切断电源，取出膜。

6）将膜浸没在5mL丽春红染色液中，置于轨道摇床上室温染色5~10min或更长，直待膜上显示出蛋白条带。

7）清洗：取出膜，用蒸馏水，PBS或者其他适当溶液冲洗至背景清晰后拍照，大概冲洗2~3次，每次5min。

8）脱色：将膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脱液，再重复一次。

9）清洗：再用蒸馏水清洗膜2~3次，每次5min。

10）将膜置于25mL封闭缓冲液中，在室温下孵育1小时。

11）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

4.抗体孵育与检测

1）将膜和一抗（SART3抗体按照产品应用推荐稀释度）置于10mL一抗稀释缓冲液中在4℃下孵育过夜并不时轻轻晃动。

2）用5mL TBST洗涤三次，每次15min以去除残留的一抗(SART3抗体)。

3）将膜和二抗（按照产品应用推荐稀释度）置于10mL封闭缓冲液中孵育1-2小时并不时轻轻晃动。

4）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同时，按照ECL超敏试剂盒说明书，新鲜配制发光工作液。

6）用平头镊取出膜，搭在滤纸上沥干洗液。将膜完全浸入发光工作液中，与发光工作液充分接触。室温孵育3min，准备立即压片曝光。但勿洗去发光液。

7）显影曝光。

应用^[4][5]

SART3抗体可以用于SART3在DNA损伤修复中的功能初探

通过构建带有GFP绿色荧光标签的质粒,再利用激光诱导活细胞产生DNA损伤,在软件的多维图像采集及分析下探究细胞核内的荧光动态变化,根据动态变化图能分析出带有GFP标签的SART3蛋白能够比较快速地募集到DNA损伤位点。接着我们再用激光诱导活细胞产生DNA损伤,通过SART3抗体免疫荧光实验进一步证实了SART3在DNA损伤位点处的募集。说明SART3能够募集到DNA损伤位点上并且可能在DNA损伤修复中发挥着比较重要的作用。

观察SART3蛋白在细胞核内DNA损伤位点处的动态募集情况,不难发现,SART3能够十分快速地被招募到损伤位点处,并在4 min左右开始弥散直至恢复到损伤之前的水平。这能够说明SART3在DNA损伤修复过程中或许扮演着比较重要的角色。然后为了继续研究SART3的各个相关结构域与激光诱导活细胞产生DNA损伤位点处募集情况的关联,我们构建了带有GFP荧光标签的SART3的一系列突变体。结果发现p EGFP-C1-Flag-SART3 D2、p EGFP-C1-FlagSART3 D5和p EGFP-C1-Flag-SART3 D8在经过激光诱导活细胞损伤之后,无法参与到DNA损伤位点的修复上。由于通过一系列实验我们已经证明了SART3能够参与到DNA损伤修复中,但是对于其具体作用机制我们还不清楚,因此使用了几种比较常见的化疗药物来处理被SART3-si RNA敲低过的细胞,来初步判断SART3主要是参与到哪种化疗药物诱导的DNA损伤反应当中,结果发现与对照组(野生型细胞)相比,实验组对化疗药物顺铂的耐药性明显升高。接下来从SART3抗体蛋白免疫印记实验中我们发现,用顺铂处理细胞,细胞内SART3的蛋白水平明显上升,这说明SART3与顺铂诱导的DNA损伤修复是有关联的。为了进一步探究SART3在DNA损伤修复中的作用,在DNA损伤修复相关基因缺陷型的小鼠成纤维细胞模型中,分析SART3在DNA损伤位点的募集情况。可以发现在PARP1缺陷型的细胞中SART3的募集情况相较于其在野生型中,募集程度明显减弱,接着再用PARP抑制剂Olaparib处理细胞,发现SART3在DNA损伤位点处的募集也大幅度降低。这些结果说明了SART3参与到DNA损伤修复的过程可能受DNA损伤修复因子PARP1的调控。

参考文献

[1]The Nucleolus and PARP1 in Cancer Biology[J].Marina Engbrecht;;Aswin Mangerich.Cancers.2020

[2]PARP inhibitors in pancreatic cancer:molecular mechanisms and clinical applications.[J].Zhu Heng;;Wei Miaoyan;;Xu Jin;;Hua Jie;;Liang Chen;;Meng Qingcai;;Zhang Yiyin;;Liu Jiang;;Zhang Bo;;Yu Xianjun;;Shi Si.Molecular cancer.2020

[3]Molecular Cloning and Characterization of an Acidic Polygalacturonase from Grapes and Its Potential in Industry[J].Nazir Zahra;Chohan Riffat;Mahmood Malik Siddique;Rehman Hafiz Muzzammel;Gul Roquyya;Saleem Mahjabeen.Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression.2020

[4]Poly-ADP ribosylation in DNA damage response and cancer therapy[J].Wei-Hsien Hou;;Shih-Hsun Chen;;Xiaochun Yu.Mutation Research-Reviews in Mutation Research.2019

[5]王慧芹.SART3在DNA损伤修复中的功能初探[D].上海师范大学,2022.