CCR1抗体的应用

背景^[1-3]

CCR1抗体是一种可以特异性结合CCR1的人工合成抗体，可以靶向结合人、小鼠、大鼠和猪样品中的CCR1蛋白。CCR1抗体可用于多种科学应用，包括Western Blot、免疫组织化学、免疫细胞化学、免疫沉淀和ELISA。

CCR1基因编码β趋化因子受体家族的一个成员，预计它是一个类似于G蛋白偶联受体的七跨膜蛋白。该受体的配体包括巨噬细胞炎症蛋白1α（MIP-1α），受正常T表达和分泌蛋白（RANTES）激活的调节，单核细胞趋化蛋白3（MCP-3）和髓系祖细胞抑制因子-1（MPIF-1）。趋化因子及其受体介导的信号转导对于效应免疫细胞募集到炎症部位至关重要。小鼠同源物的敲除研究表明，该基因在宿主保护免受炎症反应以及对病毒和寄生虫的易感性中的作用。发现该基因和其他趋化因子受体基因，包括CCR2、CCRL2、CCR3、CCR5和CCXCR1，在染色体3p上形成基因簇。

CCR1抗体

CCR1抗体使用步骤（Western Blot）：

1.样本制备

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-细胞/组织裂解液缓冲液），混匀。

2）贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g离心3-5min，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白电泳

1）取出预制胶，将预制胶固定在电泳槽中，内槽加满tris-glycine电泳缓冲液。

2）在室温或不超过37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上样缓冲液。水浴溶解后立即室温存放。

3）混合蛋白样品和5XSDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

4）100℃或沸水浴加热3-5min，以充分变性蛋白，之后冷却至室温备用。

5）上样蛋白，并在1个孔中上样蛋白marker，盖上电泳槽盖，打开电源，电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。

6）电泳后取出胶板，用刀在侧边硅胶处，沿着两片玻璃缝隙切开硅胶，即可打开玻璃板；取胶时。

3.转膜与封闭

1）将胶浸于预冷的转膜缓冲液中平衡5min。

2）依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入预冷的转膜缓冲液中平衡10min，如用PVDF膜，需参照说明书，先用纯甲醇浸泡1-2min，再孵育于预冷的转膜缓冲液中。

3）装配转移三明治：海绵/3层滤纸/胶/膜/3层滤纸/海绵，每层放好后，用试管赶尽气泡。

4）将转移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近阳极，胶靠近阴极，加入转移缓冲液，插上电极，100V，1h（电流约为0.3A）。

5）转膜结束后，切断电源，取出膜。

6）将膜浸没在5mL丽春红染色液中，置于轨道摇床上室温染色5~10min或更长，直待膜上显示出蛋白条带。

7）清洗：取出膜，用蒸馏水，PBS或者其他适当溶液冲洗至背景清晰后拍照，大概冲洗2~3次，每次5min。

8）脱色：将膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脱液，再重复一次。

9）清洗：再用蒸馏水清洗膜2~3次，每次5min。

10）将膜置于25mL封闭缓冲液中，在室温下孵育1小时。

11）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

4.抗体孵育与检测

1）将膜和一抗（CCR1抗体按照产品应用推荐稀释度）置于10mL一抗稀释缓冲液中在4℃下孵育过夜并不时轻轻晃动。

2）用5mL TBST洗涤三次，每次15min以去除残留的一抗(CCR1抗体)。

3）将膜和二抗（按照产品应用推荐稀释度）置于10mL封闭缓冲液中孵育1-2小时并不时轻轻晃动。

4）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同时，按照ECL超敏试剂盒说明书，新鲜配制发光工作液。

6）用平头镊取出膜，搭在滤纸上沥干洗液。将膜完全浸入发光工作液中，与发光工作液充分接触。室温孵育3min，准备立即压片曝光。但勿洗去发光液。

7）显影曝光。

应用^[4][5]

CCR1抗体可以用于德都红花-7味散及木犀草素通过调控CCR1、DNMT1抑制肝纤维化的作用研究

阐明德都红花-7味散及木犀草素通过调控CCR1、DNMT1抑制CCl4所致肝纤维化的影响。

方法:72只C57BL/6雄性小鼠,按体重随机分为空白组、模型组、木犀草素低剂量组、木犀草素高剂量组、蓝盆花组、德都红花-7味散组,每组12只。除空白组外,其余组采用CCl4腹腔注射建立肝纤维化模型,其余组给予相应药物灌胃4周,4周后取肝组织。CCR1抗体ELISA法检测血清中相关含量,HE染色观察肝组织的炎症活动度,Masson染色评估肝组织胶原面积,Western blot检测CCR1、DNMT1蛋白表达。

CCR1抗体结果:1.ELISA法:与模型组相比,各给药组DNMT1、a-smA、III型前胶原的血清含量表达明显减低,CCR1血清含量的表达明显升高,具有统计学意义（P<0.05）。2.HE染色:模型组多个肝细胞体积明显增大形态不规整,小叶结构紊乱、增生纤维条索交叉形成纤维间隔;各给药组肝细胞体积有所增大,其余症状明显轻于模型组。3.Masson染色:模型组中央静脉周围及汇管区胶原纤维增生,小叶结构紊乱,胶原纤维连接;各给药组与模型组相比,可见少量蓝染的胶原纤维。4.CCR1抗体Western blot法:与空白组比较模型组DNMT1、a-smA、CollagenⅠ表达显著上调,CCR1表达降低,具有统计学意义（P<0.05）,与模型组比较,各给药组DNMT1、a-smA、CollagenⅠ表达降低,CCR1升高,具有统计学意义（P<0.05）。结论:1.德都红花-7味散、蓝盆花、木犀草素减表达轻CCl4引起肝纤维化的保护作用,其通过CCR1、DNMT1、a-smA、CollagenⅠ蛋白,抑制或延缓肝纤维化。2.对肝癌表达的基因,在肝纤维化上发现DNMT1、CCR1的表达对诊断有意义,单成份、药材与成药对纤维化有显著的调解作用,为进一步诊疗预防癌症的发生,值得进一步研究。

参考文献

[1]Suppression of SUN2 by DNA methylation is associated with HSCs activation and hepatic fibrosis.[J].Chen Xin;;Li Wan-Xia;;Chen Yu;;Li Xiao-Feng;;Li Hai-Di;;Huang Hui-Min;;Bu Fang-Tian;;Pan Xue-Yin;;Yang Yang;;Huang Cheng;;Meng Xiao-Ming;;Li Jun.Cell death&disease.2018

[2]The characteristics of activated portal fibroblasts/myofibroblasts in liver fibrosis[J].Daniel Karin;;Yukinori Koyama;;David Brenner;;Tatiana Kisseleva.Differentiation.2016

[3]Origin of myofibroblasts in the fibrotic liver in mice.[J].Iwaisako Keiko;;Jiang Chunyan;;Zhang Mingjun;;Cong Min;;Moore-Morris Thomas Joseph;;Park Tae Jun;;Liu Xiao;;Xu Jun;;Wang Ping;;Paik Yong-Han;;Meng Fanli;;Asagiri Masataka;;Murray Lynne A;;Hofmann Alan F;;Iida Takashi;;Glass Christopher K;;Brenner David A;;Kisseleva Tatiana.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.2014

[4]Repression of Smad7 mediated by DNMT1 determines hepatic stellate cell activation and liver fibrosis in rats[J].Er-Bao Bian;;Cheng Huang;;Hua Wang;;Xiao-Xia Chen;;Lei Zhang;;Xiong-Wen Lv;;Jun Li.Toxicology Letters.2014

[5]韩格根套丽.德都红花-7味散及木犀草素通过调控CCR1、DNMT1抑制肝纤维化的作用研究[D].内蒙古民族大学,2023.