钙调节蛋白-1(抗体)的应用

背景^[1-3]

钙调节蛋白-1(抗体)是一种可以特异性结合钙调节蛋白-1的人工合成抗体，可以靶向结合人、小鼠、大鼠和猪样品中的钙调节蛋白-1蛋白。钙调节蛋白-1(抗体)可用于多种科学应用，包括Western Blot、免疫组织化学、免疫细胞化学、免疫沉淀和ELISA。

钙调节蛋白1是分子量为34kDa的蛋白，主要存在于平滑肌组织。它是一种高亲和力肌动蛋白结合蛋白，但是也与原肌球蛋和钙调蛋白相互作用，调节肌肉收缩。结合F-肌动蛋白时，它抑制肌动蛋白激活的肌球蛋白ATP酶的活性。钙调节蛋白1受到涉及PKC、CAMKII激酶和2A型磷酸酶的可逆磷酸化（reversible phosphorylation）调节。在非肌肉细胞中，钙调节蛋白1可能在细胞迁移、运动和增殖中起一定作用。

钙调节蛋白-1(抗体)

钙调节蛋白-1(抗体)使用步骤（Western Blot）：

1.样本制备

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-细胞/组织裂解液缓冲液），混匀。

2）贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g离心3-5min，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白电泳

1）取出预制胶，将预制胶固定在电泳槽中，内槽加满tris-glycine电泳缓冲液。

2）在室温或不超过37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上样缓冲液。水浴溶解后立即室温存放。

3）混合蛋白样品和5XSDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

4）100℃或沸水浴加热3-5min，以充分变性蛋白，之后冷却至室温备用。

5）上样蛋白，并在1个孔中上样蛋白marker，盖上电泳槽盖，打开电源，电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。

6）电泳后取出胶板，用刀在侧边硅胶处，沿着两片玻璃缝隙切开硅胶，即可打开玻璃板；取胶时。

3.转膜与封闭

1）将胶浸于预冷的转膜缓冲液中平衡5min。

2）依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入预冷的转膜缓冲液中平衡10min，如用PVDF膜，需参照说明书，先用纯甲醇浸泡1-2min，再孵育于预冷的转膜缓冲液中。

3）装配转移三明治：海绵/3层滤纸/胶/膜/3层滤纸/海绵，每层放好后，用试管赶尽气泡。

4）将转移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近阳极，胶靠近阴极，加入转移缓冲液，插上电极，100V，1h（电流约为0.3A）。

5）转膜结束后，切断电源，取出膜。

6）将膜浸没在5mL丽春红染色液中，置于轨道摇床上室温染色5~10min或更长，直待膜上显示出蛋白条带。

7）清洗：取出膜，用蒸馏水，PBS或者其他适当溶液冲洗至背景清晰后拍照，大概冲洗2~3次，每次5min。

8）脱色：将膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脱液，再重复一次。

9）清洗：再用蒸馏水清洗膜2~3次，每次5min。

10）将膜置于25mL封闭缓冲液中，在室温下孵育1小时。

11）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

4.抗体孵育与检测

1）将膜和一抗（钙调节蛋白-1(抗体)按照产品应用推荐稀释度）置于10mL一抗稀释缓冲液中在4℃下孵育过夜并不时轻轻晃动。

2）用5mL TBST洗涤三次，每次15min以去除残留的一抗(钙调节蛋白-1(抗体))。

3）将膜和二抗（按照产品应用推荐稀释度）置于10mL封闭缓冲液中孵育1-2小时并不时轻轻晃动。

4）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同时，按照ECL超敏试剂盒说明书，新鲜配制发光工作液。

6）用平头镊取出膜，搭在滤纸上沥干洗液。将膜完全浸入发光工作液中，与发光工作液充分接触。室温孵育3min，准备立即压片曝光。但勿洗去发光液。

7）显影曝光。

应用^[4][5]

钙调节蛋白-1(抗体)可以用于参芪健心方对慢性心力衰竭模型大鼠心功能及钙调节蛋白水平的影响

通过观察参芪健心方对慢性心力衰竭大鼠心功能及钙调节蛋白的影响,以进一步明确参芪健心方治疗慢性心衰的有效性及可能的机制。研究方法:实验选用SPF级雄性SD大鼠80只,体重在200±20g,适应性喂养一周后随机分为假手术组(n=10)和造模组(n=70),造模组采用左冠状动脉结扎术建立心梗后慢性心衰大鼠模型,其中,假手术组采用相同手术方法但只穿线不结扎。术后4周,将造模后的大鼠随机分为模型组、贝那普利组、参芪健心方高剂量组、中剂量组、低剂量组。贝那普利组混悬液1.2g/kg/d灌胃;中药高剂量组14.8g/kg/d、中剂量7.4g/kg/d、中药低剂量组3.7g/kg/d灌胃,模型组及假手术组予以3ml/d的生理盐水灌胃,药物干预共计4周。药物连续干预4周后,应用多普勒超声心动图对所有大鼠进行心功能检测,记录大鼠左室收缩末内径(LVIDs)、左室舒张末内径(LVIDd)、左室射血分数(LVEF)、左室短轴缩短率(LVFS)、左室收缩末容积(LVESV)、左室舒张末容积(LVEDV)。处死大鼠,采用腹主动脉取血法收集血液标本,并使用钙调节蛋白-1(抗体)酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测大鼠血清中的AngⅡ、BNP、ALD、ET-1含量。大鼠死亡后立即剪掉脏组织,并去除非组织部分,迅速将心脏冲洗干净,滤纸吸干水分后分别称重,记录大鼠心脏重量(HW),计算心重指数=全心重量/体重(HW/BW,heart weight/body weight)。将心脏组织分为两部分,其中一部分放置于4%多聚甲醛溶液中固定并使用4℃冰箱中保存,用来做HE染色和Masson染色,进行心肌细胞病理学检测及观察心肌纤维化的发生;另一部分放入-80℃冰箱中保存,以备Western Blot检测和Rt-q PCR分别检测心肌组织中SERCA2a、Ca MKⅡ、Ry R2、NCX含量及m RNA含量。

钙调节蛋白-1(抗体)研究结果血清BNP、AngⅡ、ALD、ET-1含量:与假手术组对比,模型组大鼠血清中BNP、AngⅡ、ALD、ET-1含量明显升高,差异具有统计学意义(P<0.01);与模型组相比,参芪健心方各剂量组、贝那普利组大鼠血清中BNP、AngⅡ、ALD、ET-1含量明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。

参考文献

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[4]Structure-Functional Basis of Ion Transport in Sodium–Calcium Exchanger(NCX)Proteins[J].Moshe Giladi;;Reut Shor;;Michal Lisnyansky;;Daniel Khananshvili.International Journal of Molecular Sciences.2016

[5]赵美英.参芪健心方对慢性心力衰竭模型大鼠心功能及钙调节蛋白水平的影响[D].安徽中医药大学,2021.