FABP1抗体的应用

背景^[1-3]

FABP1抗体是一种可以特异性结合FABP1的人工合成抗体，可以靶向结合人、小鼠、大鼠和猪样品中的FABP1蛋白。FABP1抗体可用于多种科学应用，包括Western Blot、免疫组织化学、免疫细胞化学、免疫沉淀和ELISA。

FABP1基因编码肝脏中发现的脂肪酸结合蛋白。脂肪酸结合蛋白是一类高度保守的小细胞质蛋白，可结合长链脂肪酸和其他疏水配体。这种蛋白质和FABP6（回肠脂肪酸结合蛋白）也能够结合胆汁酸。人们认为FABP的作用包括脂肪酸摄取、转运和代谢。

FABP1抗体

FABP1抗体使用步骤（Western Blot）：

1.样本制备

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-细胞/组织裂解液缓冲液），混匀。

2）贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g离心3-5min，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白电泳

1）取出预制胶，将预制胶固定在电泳槽中，内槽加满tris-glycine电泳缓冲液。

2）在室温或不超过37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上样缓冲液。水浴溶解后立即室温存放。

3）混合蛋白样品和5XSDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

4）100℃或沸水浴加热3-5min，以充分变性蛋白，之后冷却至室温备用。

5）上样蛋白，并在1个孔中上样蛋白marker，盖上电泳槽盖，打开电源，电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。

6）电泳后取出胶板，用刀在侧边硅胶处，沿着两片玻璃缝隙切开硅胶，即可打开玻璃板；取胶时。

3.转膜与封闭

1）将胶浸于预冷的转膜缓冲液中平衡5min。

2）依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入预冷的转膜缓冲液中平衡10min，如用PVDF膜，需参照说明书，先用纯甲醇浸泡1-2min，再孵育于预冷的转膜缓冲液中。

3）装配转移三明治：海绵/3层滤纸/胶/膜/3层滤纸/海绵，每层放好后，用试管赶尽气泡。

4）将转移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近阳极，胶靠近阴极，加入转移缓冲液，插上电极，100V，1h（电流约为0.3A）。

5）转膜结束后，切断电源，取出膜。

6）将膜浸没在5mL丽春红染色液中，置于轨道摇床上室温染色5~10min或更长，直待膜上显示出蛋白条带。

7）清洗：取出膜，用蒸馏水，PBS或者其他适当溶液冲洗至背景清晰后拍照，大概冲洗2~3次，每次5min。

8）脱色：将膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脱液，再重复一次。

9）清洗：再用蒸馏水清洗膜2~3次，每次5min。

10）将膜置于25mL封闭缓冲液中，在室温下孵育1小时。

11）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

4.抗体孵育与检测

1）将膜和一抗（FABP1抗体按照产品应用推荐稀释度）置于10mL一抗稀释缓冲液中在4℃下孵育过夜并不时轻轻晃动。

2）用5mL TBST洗涤三次，每次15min以去除残留的一抗(FABP1抗体)。

3）将膜和二抗（按照产品应用推荐稀释度）置于10mL封闭缓冲液中孵育1-2小时并不时轻轻晃动。

4）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同时，按照ECL超敏试剂盒说明书，新鲜配制发光工作液。

6）用平头镊取出膜，搭在滤纸上沥干洗液。将膜完全浸入发光工作液中，与发光工作液充分接触。室温孵育3min，准备立即压片曝光。但勿洗去发光液。

7）显影曝光。

应用^[4][5]

FABP1抗体可以用于抑制FABP1表达的化合物筛选及其改善肝细胞甘油三酯蓄积的作用机制研究

研究拟利用实验室天然小分子库,从中筛选能够有效抑制FABP1表达的小分子化合物,并探讨目标化合物在肝细胞脂代谢中的作用及其机制,从而进一步揭示FABP1在肝脏脂代谢调节中的作用,为调节机体脂代谢紊乱提供新的潜在的候选药物,具体如下。

一、基于FABP1启动子的化合物筛选及鉴定我们构建并利用p GL3-FABP1启动子荧光素酶报告载体,通过检测其荧光素酶活性,筛选出T5-40等9种抑制FABP1启动子活性的小分子化合物。之后通过检测以上小分子化合物对FABP1 m RNA和蛋白表达水平的作用,最终确认T5-40可以显著抑制FABP1表达。二、FABP1表达抑制剂T5-40对肝细胞脂代谢的调控作用为进一步探究T5-40的生物学功能,我们通过游离脂肪酸(FFA)诱导人肝癌细胞系Hep G2细胞,建立了肝细胞脂质沉积模型。600μM FFA导致Hep G2细胞内FABP1表达升高,同时甘油三酯(TG)含量明显增加,而在T5-40的作用下,显著下调了FFA导致的肝细胞FABP1蛋白表达的升高,同时降低了肝细胞内TG的含量。三、T5-40改善肝细胞TG蓄积的作用机制我们通过分别过表达和敲低FABP1进一步阐明T5-40降低肝细胞内TG的含量的机制。FABP1抗体结果表明在FFA刺激下,在Hep G2细胞内过表达FABP1,显著逆转了T5-40降低肝细胞TG水平的作用;而敲低FABP1,T5-40减少TG含量的作用没有进一步明显增强,说明T5-40下调肝细胞内TG的作用主要是通过抑制FABP1的表达实现的。最后,通过检测T5-40处理后肝细胞脂质合成及氧化相关基因m RNA水平的变化,发现T5-40导致肝细胞脂质合成相关基因的表达显著下降。此外通过检测T5-40处理后PPARα及HNF4α的表达情况,发现T5-40明显抑制HNF4α的表达,因此推测T5-40可能是通过降低HNF4α蛋白水平进而抑制FABP1基因的转录。

参考文献

[1]The role of ROS in tumour development and progression[J].Cheung Eric C.;Vousden Karen H..Nature Reviews Cancer.2022

[2]Heme-oxygenase and lipid mediators in obesity and associated cardiometabolic diseases:Therapeutic implications.[J].McClung John A;Levy Lior;Garcia Victor;Stec David E;Peterson Stephen J;Abraham Nader G.Pharmacology&therapeutics.2021

[3]DDX5 promotes oncogene C3 and FABP1 expressions and drives intestinal inflammation and tumorigenesis.[J].Abbasi Nazia;Long Tianyun;Li Yuxin;Yee Brian A;Cho Benjamin S;Hernandez Juan E;Ma Evelyn;Patel Parth R;Sahoo Debashis;Sayed Ibrahim M;Varki Nissi;Das Soumita;Ghosh Pradipta;Yeo Gene W;Huang Wendy Jia Men.Life science alliance.2020

[4]Effect and mechanism of ginsenoside Rg1-regulating hepatic steatosis in HepG2 cells induced by free fatty acid.[J].Gao Yue;;Zhang Shujun;;Li Jiajun;;Zhao Jinqiu;;Xiao Qing;;Zhu Yali;;Zhang Jia;;Huang Wenxiang.Bioscience,biotechnology,and biochemistry.2020

[5]王庚.抑制FABP1表达的化合物筛选及其改善肝细胞甘油三酯蓄积的作用机制研究[D].东北师范大学,2023.