CDCP1抗体的应用

背景^[1-3]

CDCP1抗体是一种可以特异性结合CDCP1的人工合成抗体，可以靶向结合人、小鼠、大鼠和猪样品中的CDCP1蛋白。CDCP1抗体可用于多种科学应用，包括Western Blot、免疫组织化学、免疫细胞化学、免疫沉淀和ELISA。

CDCP1，也称为CD318、TRASK和SIMA 135，是一种135-140 kDa的跨膜蛋白，在细胞外区域包含三个CUB结构域，在细胞质区域内包含一个六赖氨酸延伸。MW 80 kDa（p80）的可溶形式在N端侧的未知位点被切割。CDCP1是造血干细胞的新型标志物。

CDCP1抗体

CDCP1抗体使用步骤（Western Blot）：

1.样本制备

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-细胞/组织裂解液缓冲液），混匀。

2）贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g离心3-5min，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白电泳

1）取出预制胶，将预制胶固定在电泳槽中，内槽加满tris-glycine电泳缓冲液。

2）在室温或不超过37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上样缓冲液。水浴溶解后立即室温存放。

3）混合蛋白样品和5XSDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

4）100℃或沸水浴加热3-5min，以充分变性蛋白，之后冷却至室温备用。

5）上样蛋白，并在1个孔中上样蛋白marker，盖上电泳槽盖，打开电源，电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。

6）电泳后取出胶板，用刀在侧边硅胶处，沿着两片玻璃缝隙切开硅胶，即可打开玻璃板；取胶时。

3.转膜与封闭

1）将胶浸于预冷的转膜缓冲液中平衡5min。

2）依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入预冷的转膜缓冲液中平衡10min，如用PVDF膜，需参照说明书，先用纯甲醇浸泡1-2min，再孵育于预冷的转膜缓冲液中。

3）装配转移三明治：海绵/3层滤纸/胶/膜/3层滤纸/海绵，每层放好后，用试管赶尽气泡。

4）将转移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近阳极，胶靠近阴极，加入转移缓冲液，插上电极，100V，1h（电流约为0.3A）。

5）转膜结束后，切断电源，取出膜。

6）将膜浸没在5mL丽春红染色液中，置于轨道摇床上室温染色5~10min或更长，直待膜上显示出蛋白条带。

7）清洗：取出膜，用蒸馏水，PBS或者其他适当溶液冲洗至背景清晰后拍照，大概冲洗2~3次，每次5min。

8）脱色：将膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脱液，再重复一次。

9）清洗：再用蒸馏水清洗膜2~3次，每次5min。

10）将膜置于25mL封闭缓冲液中，在室温下孵育1小时。

11）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

4.抗体孵育与检测

1）将膜和一抗（CDCP1抗体按照产品应用推荐稀释度）置于10mL一抗稀释缓冲液中在4℃下孵育过夜并不时轻轻晃动。

2）用5mL TBST洗涤三次，每次15min以去除残留的一抗(CDCP1抗体)。

3）将膜和二抗（按照产品应用推荐稀释度）置于10mL封闭缓冲液中孵育1-2小时并不时轻轻晃动。

4）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同时，按照ECL超敏试剂盒说明书，新鲜配制发光工作液。

6）用平头镊取出膜，搭在滤纸上沥干洗液。将膜完全浸入发光工作液中，与发光工作液充分接触。室温孵育3min，准备立即压片曝光。但勿洗去发光液。

7）显影曝光。

应用^[4][5]

CDCP1抗体可以用于CDCP1在肺癌的表达及RNA干扰对肺癌细胞生长的影响

在肺癌组织、细胞系、培养的肺癌干细胞CDCP1表达研究的基础上,探讨了CDCP1 RNA干扰对基因的抑制效应及对肺癌生长的影响,并初步从细胞凋亡方面探讨了该基因在肿瘤发展中的作用。

(1) CDCPl在肺癌中的表达：为探讨CDCP1在人类肺癌中的表达与肿瘤发生、发展的相关性,通过CDCP1抗体免疫组化法检测了肺腺癌、鳞癌、大细胞肺癌、小细胞肺癌中的表达,以正常肺组织、肺良性病变及癌前病变为对照。CDCP1抗体结果显示与正常肺组织、肺良性病变及癌前病变等对照组相比,肺癌组CDCP1表达显著增加；CDCP1表达水平与肺癌病理学类型、淋巴结转移显著相关；CDCP1异常表达主要见于肺腺癌,而肺鳞癌、大细胞肺癌、小细胞肺癌异常表达率低。通过CDCP1抗体细胞免疫化学、RT-PCR、免疫印记等方法在体外研究常用肺癌细胞株也得到相似结果,即肺腺癌细胞株A549、SPC-A-1中CDCP1表达水平较高,而小细胞肺癌细胞NCI-H-446表达水平较低。在证实CDCP1在肺癌异常表达研究的基础上,为进一步探讨其在肺癌干细胞的表达水平,我们首先在体外培养了肺癌十细胞,通过CDCP1抗体免疫细胞化学法初步检测了CD133干细胞标志物,证明培养微球体的干细胞特性。在成功的4次培养物中均检测到CDCP1的表达,但表达强度存在差异。提示CDCP1也过度表达于肿瘤干细胞。本实验证实CDCP1在肺癌表达异常与肿瘤发生发展相关。常用肺腺癌细胞株A549、SPC-A-1存在CDCP1过度表达,也过度表达于肿瘤干细胞。

(2)CDCP1RNA干扰抑制基因表达及影响肺癌细胞生长CDCP1 RNA干扰显著抑制CDCP1基因的表达。CDCP1基因沉默的细胞增殖受到抑制；凋亡细胞显著增加；细胞凋亡相关蛋白caspase表达显著增加。提示CDCP1 RNA干扰显著影响该基因表达,并通过促进细胞凋亡等机制有效抑制肿瘤的生长。通过本研究我们初步证实CDCP1主要在肺腺癌异常表达、并与肿瘤的发展相关；在肺癌干细胞中也存在高表达；干扰CDCP1基因有效抑制肺癌的生长,促进细胞凋亡。推测靶向CDCP1可能在肿瘤干细胞水平发挥作用。

参考文献

[1]Durable Protection from Herpes Simplex Virus-2 Transmission Following Intravaginal Application of siRNAs Targeting Both a Viral and Host Gene[J].Yichao Wu;;Francisco Navarro;;Ashish Lal;;Emre Basar;;Rajendra K.Pandey;;Muthiah Manoharan;;Yang Feng;;Sandra J.Lee;;Judy Lieberman;;Deborah Palliser.Cell Host&Microbe,2009(1)

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[3]Global Cancer Statistics,2002[J].D.MaxParkin;FreddieBray;J.Ferlay;PaolaPisani.CA:A Cancer Journal for Clinicians,2009(2)

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[5]刘锐.CDCP1在肺癌的表达及RNA干扰对肺癌细胞生长的影响[D].吉林大学,2011.