NEDD4-2兔单克隆抗体

背景^[1-6]

NEDD4-2 Rabbit Monoclonal Antibody（NEDD4-2兔单克隆抗体）是用NEDD4-2抗原对家兔进行免疫后筛选出只产生的NEDD4-2的B淋巴细胞，再将B细胞通过细胞融合技术与骨髓瘤杂交然后筛选出只分泌NEDD4-2抗体的杂交细胞，最后通过层析柱纯化制的高纯度的NEDD4-2兔单克隆抗体。

NEDD4-L(神经前体细胞表达，发育下调4样)，又称RSP5、NEDD4-2或NEDL3，是一种定位于细胞质的975个氨基酸蛋白，包含四个WW结构域、一个HECT结构域和一个C2结构域。

NEDD4-L在胰腺、前列腺和肾脏中广泛表达，是一种E3泛素蛋白连接酶，具有E3连接酶蛋白的特性，它从E2泛素偶联酶中接受泛素(以硫酯的形式)，并将泛素残基转移到降解的底物上。通过其ubiquitinate能力和诱导等蛋白质的蛋白酶体依赖降解Smad2和TGFβRII,NEDD4-L被认为抑制TGFβ信号通路,从而调节控制细胞生长和分化的信号通路。由于可变剪接区间，NEDD4-L被表示为8种亚型。NEDD4是一种E3泛素连接酶，其靶向蛋白质以进行泛素化。

NEDD4是真核生物中高度保守的基因，是E3 HECT泛素连接酶NEDD4家族的创始成员，由人类中的9个成员组成NEDD4（该基因），NEDD4-2（NEDD4L），ITCH，SMURF1，SMURF2，WWP1，WWP2，NEDL1（HECW1）和NEDDL2（HECW2）。NEDD4通过泛素化和内吞作用调节大量膜蛋白，如离子通道和膜受体。NEDD4蛋白广泛表达，并且已经预测或证明大量蛋白质在体外结合。体内NEDD4参与多种过程的调节，包括胰岛素样生长因子信号传导，神经元结构和病毒出芽。

NEDD4是动物发育和生存的必需蛋白质。NEDD4蛋白具有模块结构，其在NEDD4家族中共享，由氨基末端C2钙依赖性磷脂结合结构域，3-4WW蛋白-蛋白相互作用结构域和羧基末端催化HECT泛素连接酶结构域组成。C2结构域将蛋白质靶向磷脂膜，也可以参与靶向底物。WW结构域与靶蛋白中富含脯氨酸的PPxY基序相互作用，介导与底物和衔接子的相互作用。所述的催化HECT结构域形成与从E2泛素结合酶转移活化泛素硫酯键，直接转移到泛素的特异性底物之前。

在体外，已显示NEDD4结合并泛素化许多离子通道和膜转运蛋白，导致其随后的蛋白酶体内吞作用和降解，包括上皮钠通道（ENaC），电压门控钙和电压门控钠通道。NEDD4介导泛素化和随后下调表皮生长因子（EGF）信号通路的组分，例如HER3和HER4 EGF受体，以及ACK。成纤维细胞生长因子受体1（FGFR1）经历NEDD4介导的遍在蛋白化和下调，并且有趣地包含结合NEDD4的C2和WW3结构域的新位点。

通过对多种病毒进行病毒基质蛋白的泛素化，NEDD4在病毒出芽中起作用，NEDD4也与出芽所需的内吞机制的组分相互作用。NEDD4也可以独立于其泛素连接酶活性起作用。NEDD4与VEGFR2相互作用，导致VEGFR2的降解，而不管HECT结构域是否具有催化活性。NEDD4可以结合并遍在上皮钠通道（ENaC），导致钠通道活性的下调。然而，体内研究表明NEDD4家族成员NEDD4-2是负责ENaC调节的主要连接酶。

应用^[7][8]

NEDD4-2兔单克隆抗体可用于NEDD4-2蛋白介导的信号通路的分子机制研究：

Angiomotin(AMOT)是一个在内皮细胞(ECs)表达的膜相关蛋白,它能够调控迁移,紧密连接(TJ)形成,细胞极性以及血管生成。在最近的研究中也揭示了AMOT,以及两个AMOT家族成员AMOTL1和AMOTL2都通过调节共转录因子YAP/TAZ的亚细胞定位,从而在Hippo pathway中发挥了重要的作用。但是,在细胞中AMOT受到了哪些调控目前为止还不是特别清楚。

在本实验中,我们发现了AMOT在细胞受到泛素化降解。当293T细胞用蛋白酶体抑制剂MG132或者lactacystin处理后,AMOT蛋白量显著升高。由于AMOT受到泛素蛋白酶体系统调控,我们便寻找负责介导AMOT泛素化的相关E3连接酶。在多个物种的AMOT同源蛋白序列比对分析中,我们发现在AMOT/p130,AMOTL1和AMOTL2的N端部分都含有三个保守的L/P-P-X-Y motifs(除了AMOT/p80)。而L/P-P-X-Y motifs可以和含有WW domain的蛋白质相互作用,比如说Nedd4-like E3 ubiquitin ligases家族。

所以我们对一些Nedd4-like E3 ubiquitin ligases家族成员做了一遍筛查,发现Nedd4,Nedd4-2和Itch可以降解AMOT的长剪接本AMOT/p130,而不能降解其短剪接本AMOT/p80。我们的数据显示Nedd4,Nedd4-2和Itch可以有效降解AMOT/p130,并且其降解作用呈剂量依赖效应,并且Nedd4,Nedd4-2和Itch也可以促进AMOT L1的降解,但是却不能促进AMOT L2的降解。我们证明了Nedd4,Nedd4-2和Itch能够在体内对AMOT/p130进行泛素化修饰。而且超表达Nedd4,Nedd4-2和Itch可以导致AMOT/p130的泛素化降解。

参考文献

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[8]安健.Nedd4-like E3泛素连接酶调控Angiomotin/p130蛋白稳定性的分子机制研究[D].复旦大学,2011.