MARK4抗体的应用

背景^[1-3]

MARK4抗体可用于多种科学应用，包括Western Blot、免疫组织化学、免疫细胞化学、免疫沉淀和ELISA。

MARK4（MAP/微管亲和调节激酶4）也称为KIAA1860、MARKL1，属于CAMK丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族和SNF1亚家族。它直接参与神经元细胞中的微管组织，并可能导致阿尔茨海默病中tau的病理磷酸化，并且在肝细胞癌变中也起作用。该蛋白质具有2种通过选择性剪接产生的亚型，分子量分别为83 kDa和75 kDa。MARK4除了全长亚型84 kDa外，还可以在阿尔茨海默病和非痴呆老年人病例的海马匀浆中以40-65 kDa的形式存在。

MARK4抗体

MARK4抗体使用步骤（Western Blot）：

1.样本制备

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-细胞/组织裂解液缓冲液），混匀。

2）贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g离心3-5min，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白电泳

1）取出预制胶，将预制胶固定在电泳槽中，内槽加满tris-glycine电泳缓冲液。

2）在室温或不超过37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上样缓冲液。水浴溶解后立即室温存放。

3）混合蛋白样品和5XSDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

4）100℃或沸水浴加热3-5min，以充分变性蛋白，之后冷却至室温备用。

5）上样蛋白，并在1个孔中上样蛋白marker，盖上电泳槽盖，打开电源，电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。

6）电泳后取出胶板，用刀在侧边硅胶处，沿着两片玻璃缝隙切开硅胶，即可打开玻璃板；取胶时。

3.转膜与封闭

1）将胶浸于预冷的转膜缓冲液中平衡5min。

2）依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入预冷的转膜缓冲液中平衡10min，如用PVDF膜，需参照说明书，先用纯甲醇浸泡1-2min，再孵育于预冷的转膜缓冲液中。

3）装配转移三明治：海绵/3层滤纸/胶/膜/3层滤纸/海绵，每层放好后，用试管赶尽气泡。

4）将转移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近阳极，胶靠近阴极，加入转移缓冲液，插上电极，100V，1h（电流约为0.3A）。

5）转膜结束后，切断电源，取出膜。

6）将膜浸没在5mL丽春红染色液中，置于轨道摇床上室温染色5~10min或更长，直待膜上显示出蛋白条带。

7）清洗：取出膜，用蒸馏水，PBS或者其他适当溶液冲洗至背景清晰后拍照，大概冲洗2~3次，每次5min。

8）脱色：将膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脱液，再重复一次。

9）清洗：再用蒸馏水清洗膜2~3次，每次5min。

10）将膜置于25mL封闭缓冲液中，在室温下孵育1小时。

11）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

4.抗体孵育与检测

1）将膜和一抗（MARK4抗体按照产品应用推荐稀释度）置于10mL一抗稀释缓冲液中在4℃下孵育过夜并不时轻轻晃动。

2）用5mL TBST洗涤三次，每次15min以去除残留的一抗(MARK4抗体)。

3）将膜和二抗（按照产品应用推荐稀释度）置于10mL封闭缓冲液中孵育1-2小时并不时轻轻晃动。

4）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同时，按照ECL超敏试剂盒说明书，新鲜配制发光工作液。

6）用平头镊取出膜，搭在滤纸上沥干洗液。将膜完全浸入发光工作液中，与发光工作液充分接触。室温孵育3min，准备立即压片曝光。但勿洗去发光液。

7）显影曝光。

应用^[4][5]

MARK4抗体可以用于MiR-150和RNA结合蛋白DAZAP1调控脑胶质瘤细胞恶性生物学行为的分子机制研究

研究旨在为胶质瘤的发生发展提供新的依据,同时为胶质瘤的分子靶向治疗提供新靶标。

研究方法:首先培养人的胶质瘤细胞U87、U251,人正常星型胶质细胞。应用Real-time PCR检测miR-150、FOXB1、DAZAP1、Linc00598、FOXE1,应用Western blot检测FOXB1、DAZAP1、FOXE1在正常脑组织、胶质瘤组织、人正常星型胶质细胞中的表达水平。应用CCK-8检测细胞增殖能力的改变。采用Transwell法检测细胞迁移和侵袭能力的改变。应用流式细胞仪和PI-FITC双染色检测细胞凋亡能力。应用通过细胞转染方法构建miR-150、FOXB1、DAZAP1、Linc00598、FOXE1过表达和表达沉默的细胞系。Real-time PCR方法检测XIAP、MMP9、FOXE1、MARK4的mRNA的表达变化。MARK4抗体Western Blot方法检测XIAP、MMP9、FOXE1、MARK4、STAU1、UPF1、LATS、p-LATS、MST、p-MST、YAP、p-YAP抗体蛋白的表达变化。双荧光素酶基因报告系统实验检测miR-150和FOXB1、Linc00598和FOXE1的靶向结合作用。应用放线菌素D-3诱导实验测定Linc00598的半衰期改变。

应用RIP和RNA-pulldown实验验证DAZAP1和Linc00598、Linc00598和FOXE1的结合。应用免疫共沉淀法检测FOXB1与MMP9和XIAP、FOXE1与MARK4启动子的直接作用。裸鼠移植瘤实验检测miR-150、FOXB1对裸鼠移植瘤的生长和荷瘤裸鼠生存时间的影响。

MARK4抗体结果:胶质瘤组织中miR-150的表达明显低于瘤周组织和正常脑组织中的表达,且随胶质瘤病理级别的升高而表达降低,U87和U251细胞中的miR-150的表达也显著低于正常人脑胶质细胞。过表达miR-150显著抑制U87和U251细胞的增殖,迁移和侵袭能力,促进细胞凋亡;沉默miR-150显著增强U87和U251细胞的增殖,迁移和侵袭能力,抑制细胞凋亡。FOXB1在胶质瘤组织中表达上调,且随胶质瘤病理级别的升高而表达升高,U87和U251细胞中的FOXB1的表达也显著高于正常人脑胶质细胞。过表达FOXB1显著增强U87和U251细胞的增殖,迁移和侵袭能力,抑制细胞凋亡;沉默FOXB1显著抑制U87和U251细胞的增殖,迁移和侵袭能力,促进细胞凋亡。miR-150与FOXB1存在靶向结合作用。过表达miR-150通过负性调控FOXB1,降低MMP9和XIAP的表达,抑制U87和U251细胞的恶性生物学行为。FOXB1与MMP9和XIAP的启动子区存在结合。过表达mi R-150联合沉默FOXB1明显抑制裸鼠移植瘤的生长和延长荷瘤裸鼠的生存期。DAZAP1在胶质瘤组织和细胞中内源性表达,且在胶质瘤组织和细胞中表达显著下调。过表达DAZAP1显著抑制胶质瘤细胞的增殖,迁移和侵袭能力,促进细胞凋亡。Linc00598在胶质瘤组织和细胞中内源性表达,且在胶质瘤组织和细胞中表达显著下调。过表达miR-217显著抑制胶质瘤细胞的增殖,迁移和侵袭能力,促进细胞凋亡。

参考文献

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[2]Long non-coding RNA Gas5 regulates proliferation and apoptosis in HCS-2/8 cells and growth plate chondrocytes by controlling FGF1 expression via miR-21 regulation.[J].Liu Xiong;;She Yuqi;;Wu Hongrong;;Zhong Da;;Zhang Jian.Journal of biomedical science.2018

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[4]Regulation of SPOCK1 by dual strands of pre-miR-150 inhibit cancer cell migration and invasion in esophageal squamous cell carcinoma.[J].Osako Yusaku;;Seki Naohiko;;Koshizuka Keiichi;;Okato Atsushi;;Idichi Tetsuya;;Arai Takayuki;;Omoto Itaru;;Sasaki Ken;;Uchikado Yasuto;;Kita Yoshiaki;;Kurahara Hiroshi;;Maemura Kosei;;Natsugoe Shoji.Journal of human genetics.2017

[5]田羽.MiR-150和RNA结合蛋白DAZAP1调控脑胶质瘤细胞恶性生物学行为的分子机制研究[D].中国医科大学,2018.