PDE4C抗体的应用

背景^[1-3]

PDE4C抗体是一种可以特异性结合PDE4C的人工合成抗体，可以靶向结合人、小鼠、大鼠和猪样品中的PDE4C蛋白。PDE4C抗体可用于多种科学应用，包括Western Blot、免疫组织化学、免疫细胞化学、免疫沉淀和ELISA。

PDE4C蛋白质属于环核苷酸磷酸二酯酶（PDE）家族和PDE4亚家族。这种PDE水解第二个信使cAMP，cAMP是许多细胞对细胞外信号反应的调节因子和介质。因此，通过调节cAMP的细胞浓度，这种蛋白质在许多重要的生理过程中起关键作用。已经为该基因描述了编码不同亚型的可变剪接转录物变体。

PDE4C抗体

PDE4C抗体使用步骤（Western Blot）：

1.样本制备

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-细胞/组织裂解液缓冲液），混匀。

2）贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g离心3-5min，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白电泳

1）取出预制胶，将预制胶固定在电泳槽中，内槽加满tris-glycine电泳缓冲液。

2）在室温或不超过37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上样缓冲液。水浴溶解后立即室温存放。

3）混合蛋白样品和5XSDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

4）100℃或沸水浴加热3-5min，以充分变性蛋白，之后冷却至室温备用。

5）上样蛋白，并在1个孔中上样蛋白marker，盖上电泳槽盖，打开电源，电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。

6）电泳后取出胶板，用刀在侧边硅胶处，沿着两片玻璃缝隙切开硅胶，即可打开玻璃板；取胶时。

3.转膜与封闭

1）将胶浸于预冷的转膜缓冲液中平衡5min。

2）依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入预冷的转膜缓冲液中平衡10min，如用PVDF膜，需参照说明书，先用纯甲醇浸泡1-2min，再孵育于预冷的转膜缓冲液中。

3）装配转移三明治：海绵/3层滤纸/胶/膜/3层滤纸/海绵，每层放好后，用试管赶尽气泡。

4）将转移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近阳极，胶靠近阴极，加入转移缓冲液，插上电极，100V，1h（电流约为0.3A）。

5）转膜结束后，切断电源，取出膜。

6）将膜浸没在5mL丽春红染色液中，置于轨道摇床上室温染色5~10min或更长，直待膜上显示出蛋白条带。

7）清洗：取出膜，用蒸馏水，PBS或者其他适当溶液冲洗至背景清晰后拍照，大概冲洗2~3次，每次5min。

8）脱色：将膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脱液，再重复一次。

9）清洗：再用蒸馏水清洗膜2~3次，每次5min。

10）将膜置于25mL封闭缓冲液中，在室温下孵育1小时。

11）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

4.抗体孵育与检测

1）将膜和一抗（PDE4C抗体按照产品应用推荐稀释度）置于10mL一抗稀释缓冲液中在4℃下孵育过夜并不时轻轻晃动。

2）用5mL TBST洗涤三次，每次15min以去除残留的一抗(PDE4C抗体)。

3）将膜和二抗（按照产品应用推荐稀释度）置于10mL封闭缓冲液中孵育1-2小时并不时轻轻晃动。

4）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同时，按照ECL超敏试剂盒说明书，新鲜配制发光工作液。

6）用平头镊取出膜，搭在滤纸上沥干洗液。将膜完全浸入发光工作液中，与发光工作液充分接触。室温孵育3min，准备立即压片曝光。但勿洗去发光液。

7）显影曝光。

应用^[4][5]

PDE4C抗体可以用于磷酸二酯酶4调节固有细胞功能参与血管重塑疾病的机制和干预研究

探究PDE4亚家族成员在心肺血管疾病中的作用及其机制。

方法与结果:前期实验室PDE4C抗体研究发现PDE4B在PH肺组织中表达上调,且主要表达在肺血管EC。(1)通过条件性基因敲除小鼠构建PH模型并进行疾病表型检测,我们发现EC中PDE4B缺失能够明显改善小鼠的PH病变,并且发现PDE4B与疾病中EC的增殖有关;(2)体外通过在小鼠肺动脉内皮细胞(mPAEC)中进行PDE4B敲低和PDE4抑制剂给药实验,PDE4C抗体结果发现mPAEC中PDE4B缺失或PDE4被抑制能够明显抑制低氧刺激诱导的mPAEC增殖和迁移;(3)通过在大鼠构建PH模型并给予PDE4B抑制剂治疗,发现PDE4B特异性抑制能够显著改善大鼠的PH病变。前期实验室研究发现PDE4D在高血压血管组织中表达增加,且体外细胞实验发现其可促进SMC收缩。(1)通过条件性基因敲除小鼠和给予PDE4抑制剂治疗并进行血管环张力检测,我们发现SMC中PDE4D缺失或全身性PDE4抑制能够明显改善高血压小鼠的阻力血管收缩异常。(2)通过对PDE4D下游信号通路进行验证,我们发现在高血压中PDE4D可通过PKA/AMPK-MYPT1/MLC信号通路增强SMC的收缩,导致阻力血管收缩异常。研究结论:PDE4亚家族的PDE4B可通过促进EC的增殖和迁移来参与PH,而PDE4D可通过促进SMC的收缩舒张异常来参与高血压,给予PDE4亚型特异性抑制剂可能是血管重塑疾病的潜在治疗方法。

参考文献

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