IRAK2抗体的应用

背景^[1-3]

IRAK2抗体是一种可以特异性结合PDX1的人工合成抗体，可以靶向结合人、小鼠、大鼠和猪样品中的IRAK2蛋白。IRAK2抗体可用于多种科学应用，包括Western Blot、免疫组织化学、免疫细胞化学、免疫沉淀和ELISA。

促炎细胞因子IL-1通过其受体的两个亚基IL-1受体I（IL-1RI）和IL-1受体辅助蛋白（IL-1RAcP）诱导细胞反应。IL-1受体相关激酶（IRAK）介导NF-kB的激活，NF-kB是介导炎症和免疫反应的关键转录因子。最近发现了IRAK/Pelle家族中的一个新成员，并将其命名为IRAK2（1）。IRAK和IRAK2在IL-1结合后募集到IL-1R复合物的亚基并导致NF-kB激活。IRAK还与Toll样受体（TLR）相关，IRAK的显性阴性突变体会抑制LPS诱导的NF-kB激活（2,3）。IRAK/Pelle家族的成员在IL-1R和TLR介导的炎症反应中起核心作用。

IRAK2抗体

IRAK2抗体使用步骤（Western Blot）：

1.样本制备

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-细胞/组织裂解液缓冲液），混匀。

2）贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g离心3-5min，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白电泳

1）取出预制胶，将预制胶固定在电泳槽中，内槽加满tris-glycine电泳缓冲液。

2）在室温或不超过37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上样缓冲液。水浴溶解后立即室温存放。

3）混合蛋白样品和5XSDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

4）100℃或沸水浴加热3-5min，以充分变性蛋白，之后冷却至室温备用。

5）上样蛋白，并在1个孔中上样蛋白marker，盖上电泳槽盖，打开电源，电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。

6）电泳后取出胶板，用刀在侧边硅胶处，沿着两片玻璃缝隙切开硅胶，即可打开玻璃板；取胶时。

3.转膜与封闭

1）将胶浸于预冷的转膜缓冲液中平衡5min。

2）依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入预冷的转膜缓冲液中平衡10min，如用PVDF膜，需参照说明书，先用纯甲醇浸泡1-2min，再孵育于预冷的转膜缓冲液中。

3）装配转移三明治：海绵/3层滤纸/胶/膜/3层滤纸/海绵，每层放好后，用试管赶尽气泡。

4）将转移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近阳极，胶靠近阴极，加入转移缓冲液，插上电极，100V，1h（电流约为0.3A）。

5）转膜结束后，切断电源，取出膜。

6）将膜浸没在5mL丽春红染色液中，置于轨道摇床上室温染色5~10min或更长，直待膜上显示出蛋白条带。

7）清洗：取出膜，用蒸馏水，PBS或者其他适当溶液冲洗至背景清晰后拍照，大概冲洗2~3次，每次5min。

8）脱色：将膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脱液，再重复一次。

9）清洗：再用蒸馏水清洗膜2~3次，每次5min。

10）将膜置于25mL封闭缓冲液中，在室温下孵育1小时。

11）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

4.抗体孵育与检测

1）将膜和一抗（IRAK2抗体按照产品应用推荐稀释度）置于10mL一抗稀释缓冲液中在4℃下孵育过夜并不时轻轻晃动。

2）用5mL TBST洗涤三次，每次15min以去除残留的一抗(IRAK2抗体)。

3）将膜和二抗（按照产品应用推荐稀释度）置于10mL封闭缓冲液中孵育1-2小时并不时轻轻晃动。

4）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同时，按照ECL超敏试剂盒说明书，新鲜配制发光工作液。

6）用平头镊取出膜，搭在滤纸上沥干洗液。将膜完全浸入发光工作液中，与发光工作液充分接触。室温孵育3min，准备立即压片曝光。但勿洗去发光液。

7）显影曝光。

应用^[4][5]

IRAK2抗体可以用于miR-424-5p/miR-322-5p通过靶向IRAK2对LPS诱导的奶牛子宫内膜炎的调控机制的研究

探索mi RNAs对于机体生理功能和病理发展的影响,仍需进行更为全面的研究。本研究中,首先通过q PCR显示mi R-424-5p或其小鼠同源基因mi R-322-5p在子宫内膜炎组织中的表达变化。随后,分别通过组织病理学、q PCR、Western blot、免疫荧光等实验探索了mi R-424-5p在LPS引发的炎症反应中的调节作用和潜在的调控机制。最后,通过IRAK2抗体双荧光素酶基因报告实验证实了mi R-424-5p可通过靶向3′-UTR而抑制IRAK2的表达。

IRAK2抗体结果表明:mi R-424-5p的超表达可以显著降低促炎细胞因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)的产生,而抑制mi R-424-5p的表达则有明显相反的作用,并最终证明mi R-424-5p是通过抑制IRAK2的表达抑制NF-κB p65的激活而抑制子宫内膜炎的发生和发展。综上所述,本论文主要研究了mi R-424-5p调控LPS诱导炎症的具体作用机制,并为奶牛子宫内膜炎及其他炎症相关疾病的治疗提供了新的靶点和思路。

参考文献

[1]MicroRNA:Could It Play a Role in Bovine Endometritis?[J].Talha Umar;Baoyi Yin;Saqib Umer;Xiaofei Ma;Kangfeng Jiang;Zaima Umar;Muhammad Akhtar;Aftab Shaukat;Ganzhen Deng.Inflammation.2021

[2]A narrative review of the roles of the miR-15/107 family in heart disease:lessons and prospects for heart disease.[J].Zheng Manni;Wang Min.Annals of translational medicine.2021

[3]Rational Design of Multistage Drug Delivery Vehicles for Pulmonary RNA Interference Therapy[J].Sofia Silva A.;Shopsowitz Kevin E.;Correa Santiago;Morton Stephen W.;Dreaden Erik C.;Casimiro Teresa;Aguiar Ricardo Ana;Hammond Paula T..International Journal of Pharmaceutics.2020

[4]TLR4 and CD14 trafficking and its influence on LPS-induced pro-inflammatory signaling[J].Anna Ciesielska;Marta Matyjek;Katarzyna Kwiatkowska.Cellular and Molecular Life Sciences.2020

[5]王诗.miR-424-5p/miR-322-5p通过靶向IRAK2对LPS诱导的奶牛子宫内膜炎的调控机制的研究[D].华中农业大学,2021.