KU0063794(mTOR抑制剂)

背景^[1-7]

KU0063794(mTOR抑制剂)是细胞通透的，小分子抑制剂，同时抑制mTORC1和mTORC2，IC50为10 nM。Ku-0063794抑制Akt，S6K和SGK的活化，以及疏水基团的磷酸化，并抑制T环残基（Thr308）磷酸化。Ku-0063794还抑制细胞生长，诱导细胞周期停滞在G1期。

与mTOR抑制剂PP242相比,KU-0063794高特异性作用于mTOR,而对PI3Ks或其他76种激酶则无作用活性。30 nM KU-0063794作用于HEK-293细胞，通过抑制疏水基团(Thr389)磷酸化，及随后的T-环残基(Thr229)磷酸化，而快速切除S6K1活性。300 nM KU-0063794作用于IGF1刺激的血清饥饿处理的HEK-293细胞，抑制~90%S6K1活性。

KU-0063794为100-300 nM时，也完全抑制氨基酸诱导的S6K1和S6蛋白磷酸化。与S6K1类似,KU-0063794抑制mTORC1在Ser2448位点磷酸化，也抑制mTORC2在Ser22481位点磷酸化，这种作用存在剂量和时间依赖性。在血清存在时，或者IGF1刺激的情况下,KU-0063794抑制Akt活性，或者Akt在Ser473和Thr308（意外的）位点磷酸化，也抑制Akt底物PRAS40在Thr246位点，GSK3α/GSK3β在Ser21/Ser9位点及Foxo-1/3a在Thr24/Thr32位点磷酸化，以上作用存在剂量依赖性。

KU-0063794而不是Rapamycin抑制SGK1活性和在Ser422位点磷酸化，也抑制其生理底物NDGR1，与抑制S6K1和Akt磷酸化程度相似，这种作用存在剂量依赖性，然而KU-0063794不抑制佛波酯诱导的ERK或RSK磷酸化和RSK激活。与Rapamycin相比,KU-0063794更有效诱导4E-BP1在Thr37,Thr46和Ser65位点完全去磷酸化。KU-0063794抑制野生型和mLST8-缺陷型MEFs细胞生长，也诱导细胞周期停在G1期，比Rapamycin效果更显著。

Ku0063794在肾脏上皮肾细胞癌的临床前模型中，抑制肿瘤生长和mTOR信号。然而，在动物研究中，Ku0063794没有temsirolimus有效，可能的原因是temsirolimus对肿瘤的微环境有重要的作用，能在异种移植瘤中减少血管生成，而Ku0063794无此效果。经Temsirolimus处理的肿瘤组织比Ku0063794处理的肿瘤组织更少地表达VEGF和PDGF。

应用^[8][9]

KU0063794(mTOR抑制剂)可用于Rictor在血管新生及成熟中的作用机制研究：

血性疾病如:脑缺血、肢体缺血、心肌缺血等已成为威胁人类健康的杀手之一。目前,促进缺血后血管新生,改善侧支循环来治疗缺血性疾病已成为心血管领域的研究热点。在血管生成至成熟过程中血管内皮细胞(endothelial cells,ECs)起到极其关键的作用。已有相关研究表明m TOR-Rictor在调节内皮细胞功能中发挥重要作用,但其在血管形成至成熟过程中的作用机制还不明确。

本课题前期研究表明Rictor缺失后,小鼠术后缺血区新生血管数量虽有增加但相对正常血管内皮细胞排列絮乱且形态不规则。为了验证Rictor在血管成熟中是否发挥作用及探索其作用机制,通过利用m TOR阻断剂KU0063794及m TORC1阻断剂Rapamycin,缺氧环境下,细胞水平间接推测m TOR-Rictor在缺血后血管成熟中的作用机制,并通过整体动物水平及细胞水平RNA干扰验证m TOR-Rictor在血管成熟中作用。采用Western Blot技术检测缺氧条件下加入不同浓度KU0063794及Rapamycin后Akt、p-Akt蛋白表达变化。

之后检测小鼠血管内皮细胞中Rictor、CX43、PDGF、TGFβ1、Smad3、e NOS、p-e NOS等与血管生成、成熟有关蛋白表达变化。KU0063794组在缺氧环境下,与空白组比较VEGF、ANG1释放量明显降低(P<0.05);Rapamycin处理组与空白组相比,VEGF释放量降低,有统计学差异(P<0.05),ANG1释放量相比空白组差别不大,提示m TOR-Rictor可促进内皮细胞释放VEGF、ANG1。

缺氧环境下,较高浓度KU0063794处理组与Rapamycin处理组相比,p-Akt、p-e NOs、TGFβ1、Smad3、CX43、PDGF蛋白表达明显降低(P<0.01),提示m TOR-Rictor可促进p-Akt、p-e NOs、TGFβ1、Smad3、CX43、PDGF蛋白表达。(5)sh RNA下调MAECs中Rictor表达相对成功,下调Rictor后,TGFβ1、CX43、PDGF、Smad3表达显著性下降(P<0.05)。QPCR检测sh RNA干扰后,Rictor,CX43、TGFβ1基因水平明显下调,且Rictor下调后,ANG1释放减少,实验结果加阻断剂后实验结果趋势一致。

参考文献

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[9]司小琴.Rictor在血管新生及成熟中的作用机制研究[D].云南中医学院,2017.