CD20(抗体)的应用

背景^[1-3]

CD20(抗体)是一种可以特异性结合PDX1的人工合成抗体，可以靶向结合人、小鼠、大鼠和猪样品中的PDX1蛋白。CD20(抗体)可用于多种科学应用，包括Western Blot、免疫组织化学、免疫细胞化学、免疫沉淀和ELISA。

CD20（Cluster of Differentiation 20）是一种跨膜磷蛋白，位于B淋巴细胞表面。B淋巴细胞是由骨髓内多能干细胞分化而成，其发育经过祖B细胞（Pro-B），前B细胞（Pre-B），不成熟B细胞（Immature B）以及成熟B细胞（Mature B）几个阶段。成熟B细胞被释放至淋巴组织，可继续分化为浆细胞（Plasma Cell）。CD20作为B细胞的表面抗原，出现在前B细胞到成熟B细胞阶段，但是CD20并不表达在造血干细胞，祖B细胞以及成熟的浆细胞上。在人体中，CD20表面抗原是由MS4A1基因编码的。

除在正常B细胞中表达外，CD20还在B细胞来源的淋巴瘤、白血病等的肿瘤细胞表达，以及和涉及免疫疾病和炎症疾病的B细胞中表达，所以CD20抗原成为淋巴癌、白血病和某些自体免疫等疾病治疗的目标靶点。

CD20(抗体)

CD20(抗体)使用步骤（Western Blot）：

1.样本制备

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-细胞/组织裂解液缓冲液），混匀。

2）贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g离心3-5min，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白电泳

1）取出预制胶，将预制胶固定在电泳槽中，内槽加满tris-glycine电泳缓冲液。

2）在室温或不超过37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上样缓冲液。水浴溶解后立即室温存放。

3）混合蛋白样品和5XSDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

4）100℃或沸水浴加热3-5min，以充分变性蛋白，之后冷却至室温备用。

5）上样蛋白，并在1个孔中上样蛋白marker，盖上电泳槽盖，打开电源，电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。

6）电泳后取出胶板，用刀在侧边硅胶处，沿着两片玻璃缝隙切开硅胶，即可打开玻璃板；取胶时。

3.转膜与封闭

1）将胶浸于预冷的转膜缓冲液中平衡5min。

2）依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入预冷的转膜缓冲液中平衡10min，如用PVDF膜，需参照说明书，先用纯甲醇浸泡1-2min，再孵育于预冷的转膜缓冲液中。

3）装配转移三明治：海绵/3层滤纸/胶/膜/3层滤纸/海绵，每层放好后，用试管赶尽气泡。

4）将转移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近阳极，胶靠近阴极，加入转移缓冲液，插上电极，100V，1h（电流约为0.3A）。

5）转膜结束后，切断电源，取出膜。

6）将膜浸没在5mL丽春红染色液中，置于轨道摇床上室温染色5~10min或更长，直待膜上显示出蛋白条带。

7）清洗：取出膜，用蒸馏水，PBS或者其他适当溶液冲洗至背景清晰后拍照，大概冲洗2~3次，每次5min。

8）脱色：将膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脱液，再重复一次。

9）清洗：再用蒸馏水清洗膜2~3次，每次5min。

10）将膜置于25mL封闭缓冲液中，在室温下孵育1小时。

11）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

4.抗体孵育与检测

1）将膜和一抗（CD20(抗体)按照产品应用推荐稀释度）置于10mL一抗稀释缓冲液中在4℃下孵育过夜并不时轻轻晃动。

2）用5mL TBST洗涤三次，每次15min以去除残留的一抗(CD20(抗体))。

3）将膜和二抗（按照产品应用推荐稀释度）置于10mL封闭缓冲液中孵育1-2小时并不时轻轻晃动。

4）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同时，按照ECL超敏试剂盒说明书，新鲜配制发光工作液。

6）用平头镊取出膜，搭在滤纸上沥干洗液。将膜完全浸入发光工作液中，与发光工作液充分接触。室温孵育3min，准备立即压片曝光。但勿洗去发光液。

7）显影曝光。

应用^[4][5]

CD20(抗体)可以用于抗CD20单克隆抗体治疗对小鼠肺腺癌的影响

构建T739小鼠肺腺癌肿瘤模型,通过在肿瘤发展的不同时期注射抗CD20单克隆抗体,探究抗CD20单克隆抗体对肺腺癌发展不同阶段的作用以及对肠道菌群和相关免疫细胞的影响。

方法：通过皮下注射小鼠肺腺癌细胞系LA795构建T739小鼠肺腺癌模型。在皮下荷瘤模型的基础上,将小鼠分为三组;荷瘤前注射抗CD20单抗组、成瘤后注射抗CD20单抗组与对照荷瘤组;抗CD20单抗处理组分别在荷瘤前后通过尾静脉对小鼠注射抗CD20单抗,对照组注射相同剂量的PBS。各组分别绘制肿瘤生长曲线,记录肿瘤的体积和质量;采用HE染色与CD20(抗体)免疫荧光技术,观察皮下肿瘤组织的结构以及T细胞的分布;同时采用流式细胞术分别检测不同皮下荷瘤组小鼠外周血与脾中B细胞的比例,以及皮下荷瘤小鼠引流淋巴结中B细胞、T细胞和NK细胞的比例及活化状态;之后基于边合成边测序技术,利用Illumina平台对肿瘤组织中的c DNA进行了高通量测序,进行差异表达基因功能注释及富集分析;最后基于Illumina Novaseq测序平台,利用双末端测序的方法,构建小片段文库对小鼠肠道微生物群进行差异分析。

CD20(抗体)结果1.肺腺癌荷瘤小鼠模型的建立:对T739小鼠皮下注射1x106个LA795小鼠肺腺癌细胞,皮下可见肿瘤生长;取肿瘤组织HE染色,镜下可见大量排列紧密,核大深染的细胞。2.不同时间注射抗CD20单抗对肺腺癌生长的影响:(1)荷瘤前注射抗CD20单抗组小鼠的肿瘤体积显著小于对照组小鼠(P<0.01),成瘤后注射抗CD20单抗组小鼠的肿瘤体积与对照组无显著差异(P>0.05)。(2)HE染色结果表明,与对照组相比,荷瘤前注射抗CD20单抗组肿瘤细胞坏死明显,表现为核破裂、固缩,肿瘤的内部结构更加松散,而成瘤后再注射抗CD20单抗组肿瘤内部无明显坏死。3.免疫荧光结果显示,与对照组相比,荷瘤前注射抗CD20单抗组肿瘤内的CD4+T细胞浸润显著增加,且CD4+T和CD8+T细胞呈共定位现象,有利于二者的相互活化。

参考文献

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