PDX1抗体的应用

背景^[1-3]

PDX1抗体是一种可以特异性结合PDX1的人工合成抗体，可以靶向结合人、小鼠、大鼠和猪样品中的PDX1蛋白。PDX1抗体可用于多种科学应用，包括Western Blot、免疫组织化学、免疫细胞化学、免疫沉淀和ELISA。

胰十二指肠同源-1蛋白（PDX-1），也称为INS启动子因子（IPF1）、INS上游因子1（IUF1）、生长抑素反式激活因子-1（STF-1）和葡萄糖敏感因子（GSF），PDX1是一种存在于胰腺β细胞中的含有282个氨基酸的同源结构域转录因子。PDX-1是β细胞中胰岛发育和INS基因转录的关键调节因子。PDX-1在发育早期在所有细胞中表达，主要局限于成人的胰腺和十二指肠。HNF-3b、HNF-1a和SP1正向调节PDX-1增强子元件。PDX-1还通过激活腺苷酸环化酶受胰高血糖素样肽的调节，从而导致细胞内cAMP活性增加。cAMP水平升高以及由此产生的PKA激活导致PDX-1转录增加和蛋白质向β细胞核的易位。PDX-1与序列C（C/T）结合，可以与PBX异二聚化。PDX-1在高葡萄糖浓度下被SAPK2通路磷酸化。PDX-1基因突变可导致年轻人成熟型糖尿病和胰腺发育不全。

PDX1抗体

PDX1抗体使用步骤（Western Blot）：

1.样本制备

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-细胞/组织裂解液缓冲液），混匀。

2）贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g离心3-5min，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白电泳

1）取出预制胶，将预制胶固定在电泳槽中，内槽加满tris-glycine电泳缓冲液。

2）在室温或不超过37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上样缓冲液。水浴溶解后立即室温存放。

3）混合蛋白样品和5XSDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

4）100℃或沸水浴加热3-5min，以充分变性蛋白，之后冷却至室温备用。

5）上样蛋白，并在1个孔中上样蛋白marker，盖上电泳槽盖，打开电源，电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。

6）电泳后取出胶板，用刀在侧边硅胶处，沿着两片玻璃缝隙切开硅胶，即可打开玻璃板；取胶时。

3.转膜与封闭

1）将胶浸于预冷的转膜缓冲液中平衡5min。

2）依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入预冷的转膜缓冲液中平衡10min，如用PVDF膜，需参照说明书，先用纯甲醇浸泡1-2min，再孵育于预冷的转膜缓冲液中。

3）装配转移三明治：海绵/3层滤纸/胶/膜/3层滤纸/海绵，每层放好后，用试管赶尽气泡。

4）将转移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近阳极，胶靠近阴极，加入转移缓冲液，插上电极，100V，1h（电流约为0.3A）。

5）转膜结束后，切断电源，取出膜。

6）将膜浸没在5mL丽春红染色液中，置于轨道摇床上室温染色5~10min或更长，直待膜上显示出蛋白条带。

7）清洗：取出膜，用蒸馏水，PBS或者其他适当溶液冲洗至背景清晰后拍照，大概冲洗2~3次，每次5min。

8）脱色：将膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脱液，再重复一次。

9）清洗：再用蒸馏水清洗膜2~3次，每次5min。

10）将膜置于25mL封闭缓冲液中，在室温下孵育1小时。

11）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

4.抗体孵育与检测

1）将膜和一抗（PDX1抗体按照产品应用推荐稀释度）置于10mL一抗稀释缓冲液中在4℃下孵育过夜并不时轻轻晃动。

2）用5mL TBST洗涤三次，每次15min以去除残留的一抗(PDX1抗体)。

3）将膜和二抗（按照产品应用推荐稀释度）置于10mL封闭缓冲液中孵育1-2小时并不时轻轻晃动。

4）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同时，按照ECL超敏试剂盒说明书，新鲜配制发光工作液。

6）用平头镊取出膜，搭在滤纸上沥干洗液。将膜完全浸入发光工作液中，与发光工作液充分接触。室温孵育3min，准备立即压片曝光。但勿洗去发光液。

7）显影曝光。

应用^[4][5]

PDX1抗体可以用于抗CD20单克隆抗体与IL-10基因联合干预对NOD鼠肝脏PDX1及FOXO1的影响

观察抗CD20单克隆抗体与IL-10基因联合应用对NOD鼠肝脏PDX1及FOXO1表达的影响。

方法:将雌性已发病的NOD鼠24只,随机分为A:抗CD20单克隆抗体组(于发病第1天尾静脉注射500ug抗CD20单克隆抗体,并于第3、6、9天尾静脉注射250ug抗CD20单克隆抗体),B:抗CD20单克隆抗体+IL-10基因组(第1天尾静脉注射500ug抗CD20单克隆抗体+0.1ml IL-10基因,后相同时间尾静脉注射500ug抗CD20单克隆抗体+0.1ml IL-10基因),C:IL-10基因组:相同时间于尾静脉给予0.1ml IL-10基因,D:生理盐水对照组:相同时间给予0.1ml生理盐水。发病后每3天测量1次体重;每天同一时间监测血糖。观察6周后行ELISA法检测血清中C肽、TNF-α、IL-10、CD20的表达水平,PDX1抗体免疫组化、western检测肝脏中PDX1、FOXO1蛋白表达情况,并行PCR法了解PDX1、FOXO1基因表达情况。结果:联合治疗组血清C肽水平高于其他组,血清TNF-α水平低于其他组,差异均具有有统计学意义(P<0.05);联合治疗组肝脏中PDX1基因及蛋白表达水平高于其他三组,FOXO1基因及蛋白表达水平低于其他组,差异亦具有统计学意义(P<0.05)。结论:抗CD20单克隆抗体与IL-10基因组联合应用促进肝脏中PDX1蛋白的表达,降低FOXO1的表达。

参考文献

[1]Permanent Neonatal Diabetes and Enteric Anendocrinosis Associated With Biallelic Mutations in NEUR0G3[J].Rubio-Cabezas,Oscar;Jensen,Jan N;Hodgson,Maria I;Codner,Ethel;Ellard,Sian;Serup,Palle;Hattersley,Andrew T.Diabetes.2011

[2]FoxO1 Links Insulin Resistance to Proinflammatory Cytokine IL-1[beta]Production in Macrophages[J].Su,Dongming;Coudriet,Gina M;Kim,Dae Hyun;Lu,Yi;Perdomo,German;Qu,Shen;Slusher,Sandra;Tse,Hubert M;Piganelli,Jon;Giannoukakis,Nick;Zhang,Jian;Dong,H Henry.Diabetes,2009(11)

[3]Incidence trends for childhood type 1 diabetes in Europe during 1989–2003 and predicted new cases 2005–20:a multicentre prospective registration study[J].Christopher C Patterson;;Gisela G Dahlquist;;Eva Gyürüs;;Anders Green;;Gyula Soltész.The Lancet,2009(9680)

[4]Notch signaling reveals developmental plasticity of Pax4+pancreatic endocrine progenitors and shunts them to a duct fate[J].Amy L.Greenwood;;Sui Li;;Kevin Jones;;Douglas A.Melton.Mechanisms of Development,2007(2)

[5]范磊.抗CD20单克隆抗体与IL-10基因联合干预对NOD鼠肝脏PDX1及FOXO1的影响[D].青岛大学,2016.