DGKD抗体的应用

背景^[1-3]

DGKD抗体是一种可以特异性结合DGKD的人工合成抗体，可以靶向结合人、小鼠、大鼠和猪样品中的DGKD蛋白。DGKD抗体可用于多种科学应用，包括Western Blot、免疫组织化学、免疫细胞化学、免疫沉淀和ELISA。

DGKD抗体

DGKD抗体使用步骤（Western Blot）：

1.样本制备

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-细胞/组织裂解液缓冲液），混匀。

2）贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g离心3-5min，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白电泳

1）取出预制胶，将预制胶固定在电泳槽中，内槽加满tris-glycine电泳缓冲液。

2）在室温或不超过37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上样缓冲液。水浴溶解后立即室温存放。

3）混合蛋白样品和5XSDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

4）100℃或沸水浴加热3-5min，以充分变性蛋白，之后冷却至室温备用。

5）上样蛋白，并在1个孔中上样蛋白marker，盖上电泳槽盖，打开电源，电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。

6）电泳后取出胶板，用刀在侧边硅胶处，沿着两片玻璃缝隙切开硅胶，即可打开玻璃板；取胶时。

3.转膜与封闭

1）将胶浸于预冷的转膜缓冲液中平衡5min。

2）依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入预冷的转膜缓冲液中平衡10min，如用PVDF膜，需参照说明书，先用纯甲醇浸泡1-2min，再孵育于预冷的转膜缓冲液中。

3）装配转移三明治：海绵/3层滤纸/胶/膜/3层滤纸/海绵，每层放好后，用试管赶尽气泡。

4）将转移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近阳极，胶靠近阴极，加入转移缓冲液，插上电极，100V，1h（电流约为0.3A）。

5）转膜结束后，切断电源，取出膜。

6）将膜浸没在5mL丽春红染色液中，置于轨道摇床上室温染色5~10min或更长，直待膜上显示出蛋白条带。

7）清洗：取出膜，用蒸馏水，PBS或者其他适当溶液冲洗至背景清晰后拍照，大概冲洗2~3次，每次5min。

8）脱色：将膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脱液，再重复一次。

9）清洗：再用蒸馏水清洗膜2~3次，每次5min。

10）将膜置于25mL封闭缓冲液中，在室温下孵育1小时。

11）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

4.抗体孵育与检测

1）将膜和一抗（DGKD抗体按照产品应用推荐稀释度）置于10mL一抗稀释缓冲液中在4℃下孵育过夜并不时轻轻晃动。

2）用5mL TBST洗涤三次，每次15min以去除残留的一抗(DGKD抗体)。

3）将膜和二抗（按照产品应用推荐稀释度）置于10mL封闭缓冲液中孵育1-2小时并不时轻轻晃动。

4）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同时，按照ECL超敏试剂盒说明书，新鲜配制发光工作液。

6）用平头镊取出膜，搭在滤纸上沥干洗液。将膜完全浸入发光工作液中，与发光工作液充分接触。室温孵育3min，准备立即压片曝光。但勿洗去发光液。

7）显影曝光。

应用^[4][5]

DGKD抗体可以用于亮氨酸缺失对肝脏脂质代谢的调节功能研究

通过转录组学和蛋白质组学研究肝脏中受亮氨酸缺失调节的关键基因和蛋白质。转录组学DGKD抗体鉴定到亮氨酸缺失上调SP代谢相关基因Sgms1、Cers6、Acer2和Asah1的表达水平;而在GL和GP代谢中,亮氨酸缺失上调Pnpla2、Dgkd、Lpin1、Plpp2和Plpp3基因表达水平,下调Gpam、Lpic和Agpat2基因表达水平。基因集富集分析(GSEA)结果表明亮氨酸缺失抑制了肝脏中一系列脂质代谢相关的信号通路,包括脂肪酸代谢、不饱和脂肪酸合成、丁酸代谢、丙酮酸代谢、PPAR信号通路等,同时激活MAPK和磷脂酶D信号通路。i TRAQ蛋白质组学数据表明亮氨酸缺失显著下调了脂肪酸合成相关蛋白(如ACACA、ACACB、ACSL5)和脂肪酸去饱和酶(如FADS1、FADS2、ACOD1)的表达水平。随后,本研究将脂质组学和转录组学数据进行联合分析,确定了亮氨酸缺失调控SP代谢(Sgms1、Cers6、Acer2和Asah1)、GL和GP代谢(Pnpla2、Dgkd、Lpin1、Gpam、和Agpat2)的关键基因表达。在体外试验中,亮氨酸剥夺处理AML12细胞0、12、24、48小时,结果发现处理超过12小时后细胞内SM含量随处理时间延长而持续增加。而PI染色结果显示亮氨酸剥夺超过12小时后,细胞形态出现异常,细胞死亡(或细胞膜受损)显著增加。DGKD抗体Western blot结果发现,-Leu小鼠肝脏组织和AML12细胞中SGMS1蛋白表达水平随亮氨酸缺失时间的延长而增加,这进一步证明了SGMS1是亮氨酸缺失导致肝脏SM水平增加的关键蛋白。此外,体内外试验结果均表明亮氨酸缺失会显著下调脂肪酸合成相关蛋白FASN和ACC1的表达水平,而脂肪酸氧化相关蛋白ACOX1和ACSL1的表达水平无显著变化。

参考文献

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[5]余灏南.亮氨酸缺失对肝脏脂质代谢的调节功能研究[D].华中农业大学,2023.