VIP抗体的应用

背景^[1-3]

VIP抗体是一种IgG2bκ小鼠单克隆VIP抗体（也称为胰高血糖素（血管扩张诱导）家族成员抗体、血管活性肠多肽（VIP）抗体、28个氨基酸胰高血糖素/分泌素超家族配体抗体、G蛋白偶联受体（GPCR）VPAC1/VPAC2配体抗体或PHM27抗体），可通过WB、IP、IF、IHC(P)和ELISA检测人类来源的VIP蛋白。VIP抗体（H-6）既可作为非偶联抗VIP抗体形式，也可作为多种偶联形式的抗VIP抗体，包括琼脂糖、HRP、PE、FITC和多种Alexa Fluor®偶联物。胰高血糖素是一种胰腺激素，可作为胰岛素的拮抗剂，刺激糖原向葡萄糖转化，提高血糖水平。胰高血糖素样肽-1（GLP-1）、胰高血糖素样肽-2（GLP-2）、VIP（血管活性肠肽）和PACAP（垂体腺苷酸环化酶激活多肽）是胰高血糖素激素家族的成员。GLP-1在中枢神经系统中起传递作用，抑制摄食和饮水行为，而GLP-2是肠上皮生长的促进剂。VIP引起血管扩张，导致血压降低。PACAP在下丘脑中含量丰富，已证明可增加多种激素的合成，包括生长激素。

VIP抗体

VIP抗体使用步骤（Western Blot）：

1.样本制备

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-细胞/组织裂解液缓冲液），混匀。

2）贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g离心3-5min，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白电泳

1）取出预制胶，将预制胶固定在电泳槽中，内槽加满tris-glycine电泳缓冲液。

2）在室温或不超过37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上样缓冲液。水浴溶解后立即室温存放。

3）混合蛋白样品和5XSDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

4）100℃或沸水浴加热3-5min，以充分变性蛋白，之后冷却至室温备用。

5）上样蛋白，并在1个孔中上样蛋白marker，盖上电泳槽盖，打开电源，电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。

6）电泳后取出胶板，用刀在侧边硅胶处，沿着两片玻璃缝隙切开硅胶，即可打开玻璃板；取胶时。

3.转膜与封闭

1）将胶浸于预冷的转膜缓冲液中平衡5min。

2）依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入预冷的转膜缓冲液中平衡10min，如用PVDF膜，需参照说明书，先用纯甲醇浸泡1-2min，再孵育于预冷的转膜缓冲液中。

3）装配转移三明治：海绵/3层滤纸/胶/膜/3层滤纸/海绵，每层放好后，用试管赶尽气泡。

4）将转移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近阳极，胶靠近阴极，加入转移缓冲液，插上电极，100V，1h（电流约为0.3A）。

5）转膜结束后，切断电源，取出膜。

6）将膜浸没在5mL丽春红染色液中，置于轨道摇床上室温染色5~10min或更长，直待膜上显示出蛋白条带。

7）清洗：取出膜，用蒸馏水，PBS或者其他适当溶液冲洗至背景清晰后拍照，大概冲洗2~3次，每次5min。

8）脱色：将膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脱液，再重复一次。

9）清洗：再用蒸馏水清洗膜2~3次，每次5min。

10）将膜置于25mL封闭缓冲液中，在室温下孵育1小时。

11）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

4.抗体孵育与检测

1）将膜和一抗（VIP抗体按照产品应用推荐稀释度）置于10mL一抗稀释缓冲液中在4℃下孵育过夜并不时轻轻晃动。

2）用5mL TBST洗涤三次，每次15min以去除残留的一抗(VIP抗体)。

3）将膜和二抗（按照产品应用推荐稀释度）置于10mL封闭缓冲液中孵育1-2小时并不时轻轻晃动。

4）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同时，按照ECL超敏试剂盒说明书，新鲜配制发光工作液。

6）用平头镊取出膜，搭在滤纸上沥干洗液。将膜完全浸入发光工作液中，与发光工作液充分接触。室温孵育3min，准备立即压片曝光。但勿洗去发光液。

7）显影曝光。

应用^[4][5]

VIP抗体可以用于ITP患者中医证候特征及其与TPO、VIP水平相关性探讨

总结成人原发免疫性血小板减少症(ITP)的中医证候分布特点,评价ITP患者外周血血小板生成素(TPO)水平、血管活性肠肽(VIP)水平与ITP的相关性,及与中医证候的相关性。探讨本病可能发病机制,为中医证的研究提供客观依据。

方法:1.从2018年6月至2019年1月在北京中医药大学东直门医院血液肿瘤科门诊及病房就诊的ITP患者中,筛选符合标准的病例,采集完整的病例资料及中医四诊信息,分析ITP的中医证候分布特点;2.应用酶联免疫分析法(ELISA)VIP抗体测定ITP组、再生障碍性贫血(AA)组、正常对照组的人外周血血浆TPO水平、VIP水平,统计分析TPO、VIP水平与血小板计数、出血程度等相关性,比较各证候间实验室指标的差异性。

VIP抗体结果:1.一般情况:纳入符合标准的ITP患者64例,AA患者15例,正常对照27例。ITP组男性23例,女性41例,平均年龄44.48±12.21岁,病程平均数为74.74±114.34个月,中位病程24.50个月。新诊断ITP 3例,持续性ITP 13例,慢性ITP 48例。重症ITP 5例,难治性ITP 15例。血小板计数最低者为5(×109/L),最高者为243(×109/L),平均数为51.61±43.20(×109/L),中位血小板数为38.50(×109/L)。剔除1例血小板计数正常患者后,出血倾向评分0、1、2、3、4分者分别为39、13、4、6、1例,未有评分大于4分者。39例(61.90%)患者无出血表现,24例(38.10%)患者有出血表现。有出血表现患者中,皮肤出血频次为18次(75.00%),黏膜出血频次为6次(25.00%),未有出现深部器官出血及致命性出血、中枢神经系统出血者。出血倾向评分与血小板数值呈负相关(r=-0.271,P=0.032)。

参考文献

[1]Beyond immune thrombocytopenia:the evolving role of thrombopoietin receptor agonists[J].Francesco Rodeghiero;;Giuseppe Carli.Annals of Hematology,2017(9)

[2]Eltrombopag safety and efficacy for primary chronic immune thrombocytopenia in clinical practice[J].Tomás JoséGonzález‐López;;María Teresa Alvarez‐Román;;Cristina Pascual;;Blanca Sánchez‐González;;Fernando Fernández‐Fuentes;;Isidro Jarque;;Gloria Pérez‐Rus;;Susana Pérez‐Crespo;;Silvia Bernat;;JoséAngel Hernández‐Rivas;;Marcio M.Andrade;;Montserrat Cortés;;Marta Gómez‐Nu?ez;;Pavel Olivera;;Violeta Martínez‐Robles;;Angeles Fernández‐Rodríguez;;Miguel Angel Fuertes‐Palacio;;Carmen Fernández‐Mi?ano;;Erik Cabo;;Rosa Fisac;;Carlos Aguilar;;Abelardo Bárez;;María Jesús Pe?arrubia;;Luis Javier García‐Frade;;Jos.European Journal of Haematology,2016(3)

[3]The neuropeptide vasoactive intestinal peptide:direct effects on immune cells and involvement in inflammatory and autoimmune diseases[J].D.Ganea;;K.M.Hooper;;W.Kong.Acta Physiol,2015(2)

[4]Rescue Therapy With Romiplostim for Refractory Primary Immune Thrombocytopenia During Pregnancy[J].Justine Decroocq;;Louis Marcellin;;Camille Le Ray;;Lise Willems.Obstetrics&Gynecology,2014(2,P)

[5]钱树树.ITP患者中医证候特征及其与TPO、VIP水平相关性探讨[D].北京中医药大学,2019.