XAF1抗体的应用

背景^[1-3]

XAF1抗体是一种可以特异性结合XAF1的人工合成抗体，可以靶向结合人、小鼠、大鼠和猪样品中的XAF1蛋白。XAF1抗体可用于多种科学应用，包括Western Blot、免疫组织化学、免疫细胞化学、免疫沉淀和ELISA。

XAF1是一种锌指蛋白，可阻断XIAP的抗凋亡活性。XIAP是内源性凋亡抑制蛋白（IAPs）家族成员之一，通过抑制半胱天冬酶来抑制细胞凋亡。在XAF1存在的情况下，XIAP蛋白会从细胞质重新分布到细胞核。XAF1转录本（3.9-、4.5-、6.0-和7.0-kb）在心脏和卵巢中表达水平较高。XAF1 mRNA的低表达是某些癌症（WM164黑色素瘤、WM35黑色素瘤、U937前单核细胞白血病和HT1080纤维肉瘤）的指标，这表明XAF1转录本的低水平可能通过相对增加XIAP的抗凋亡功能来增强癌细胞的存活。IFN-α和IFN-β可激活人类XAF1基因，该基因定位于染色体17p13.2。

XAF1抗体

XAF1抗体使用步骤（Western Blot）：

1.样本制备

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-细胞/组织裂解液缓冲液），混匀。

2）贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g离心3-5min，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白电泳

1）取出预制胶，将预制胶固定在电泳槽中，内槽加满tris-glycine电泳缓冲液。

2）在室温或不超过37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上样缓冲液。水浴溶解后立即室温存放。

3）混合蛋白样品和5XSDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

4）100℃或沸水浴加热3-5min，以充分变性蛋白，之后冷却至室温备用。

5）上样蛋白，并在1个孔中上样蛋白marker，盖上电泳槽盖，打开电源，电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。

6）电泳后取出胶板，用刀在侧边硅胶处，沿着两片玻璃缝隙切开硅胶，即可打开玻璃板；取胶时。

3.转膜与封闭

1）将胶浸于预冷的转膜缓冲液中平衡5min。

2）依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入预冷的转膜缓冲液中平衡10min，如用PVDF膜，需参照说明书，先用纯甲醇浸泡1-2min，再孵育于预冷的转膜缓冲液中。

3）装配转移三明治：海绵/3层滤纸/胶/膜/3层滤纸/海绵，每层放好后，用试管赶尽气泡。

4）将转移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近阳极，胶靠近阴极，加入转移缓冲液，插上电极，100V，1h（电流约为0.3A）。

5）转膜结束后，切断电源，取出膜。

6）将膜浸没在5mL丽春红染色液中，置于轨道摇床上室温染色5~10min或更长，直待膜上显示出蛋白条带。

7）清洗：取出膜，用蒸馏水，PBS或者其他适当溶液冲洗至背景清晰后拍照，大概冲洗2~3次，每次5min。

8）脱色：将膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脱液，再重复一次。

9）清洗：再用蒸馏水清洗膜2~3次，每次5min。

10）将膜置于25mL封闭缓冲液中，在室温下孵育1小时。

11）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

4.抗体孵育与检测

1）将膜和一抗（XAF1抗体按照产品应用推荐稀释度）置于10mL一抗稀释缓冲液中在4℃下孵育过夜并不时轻轻晃动。

2）用5mL TBST洗涤三次，每次15min以去除残留的一抗(XAF1抗体)。

3）将膜和二抗（按照产品应用推荐稀释度）置于10mL封闭缓冲液中孵育1-2小时并不时轻轻晃动。

4）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同时，按照ECL超敏试剂盒说明书，新鲜配制发光工作液。

6）用平头镊取出膜，搭在滤纸上沥干洗液。将膜完全浸入发光工作液中，与发光工作液充分接触。室温孵育3min，准备立即压片曝光。但勿洗去发光液。

7）显影曝光。

应用^[4][5]

XAF1抗体可以用于XAF1在卵巢癌组织中的表达及作用机制的实验研究

XAF1和XIAP在卵巢癌组织中的表达及临床意义研究目的：检测促凋亡因子XAF1和凋亡抑制因子XIAP在上皮性卵巢肿瘤组织中的表达,探讨XAF1及XIAP的表达与患者临床病理特征、预后及MVD的关系。

资料方法：选取山东大学齐鲁医院2003年9月至2008年12月手术切除的上皮性卵巢癌（Ⅱ-Ⅳ期）组织共94例、卵巢囊腺瘤组织30例,进行XAF1抗体免疫组化染色,检测XAF1和XIAP在EOC及卵巢囊腺瘤组织中的表达,行CD31抗体染色,检测组织中微血管密度（MVD）。收集患者完整的临床信息,包括患者的年龄、FIGO（Federation International of Gynecology and Obstetrics）分期、病理类型、细胞分级、是否存活等并对其进行统计分析。

XAF1抗体结果：1.XAF1和XIAP在卵巢肿瘤组织中的表达免疫组化结果显示XAF1在卵巢上皮细胞浆中表达,细胞核中几乎无表达,EOC细胞中XAF1表达强度及广度均低于卵巢囊腺瘤（3.35±2.54vs.5.63±2.72;p<0.001）。XIAP在卵巢上皮细胞胞浆中表达,卵巢囊腺瘤上皮细胞中XIAP着色强度及广度明显低于EOC细胞（2.13±2.11vs.3.87±2.46；p<0.001）。2.XAF1和XIAP在EOC组织中表达与临床病理参数的关系XAF1蛋白表达与卵巢癌细胞分级有关,高中分化细胞（G1、G2）中XAF1高表达率为54.3%（19/35）,低分化细胞（G3）中XAF1高表达率为30.5%（18/59）,差异有统计学意义（p<0.05）。FIGO分期为Ⅲ及Ⅳ期的卵巢癌患者中XAF1高表达率为33.8%（23/68）,低于Ⅱ期患者（53.8%,14/26）,但差异无统计学意义（p=0.099）。XIAP蛋白表达与患者年龄、FIGO分期、组织病理类型、淋巴结转移和细胞分级等临床病理参数无明显相关性。3.XAF1和XIAP在EOC组织中表达与组织微血管密度（MVD）的相关性分析EOC组织中MVD的中位值为12/HPF（3-31）(×400),XAF1在EOC中蛋白表达与MVD密切相关,XAF1低表达组中MVD明显高于XAF1高表达组（15.46±7.48vs.10.95±5.33）,差异有统计学意义（p<0.01）。XIAP低表达组MVD低于XIAP高表达组（12.65±6.39vs.14.80±7.60）,但差异无统计学意义（p=0.141）。

参考文献

[1]Double inhibition of NF-κB and XIAP via RNAi enhances the sensitivityof pancreatic cancer cells to gemcitabine[J].Li-Ping Cao;;Jian-Lin Song;;Xiao-Ping Yi;;Yi-Xiong Li.Oncology Reports,2013(4)

[2]XIAP downregulation accompanies mebendazole growth inhibition in melanoma xenografts[J].Nicole A.Doudican;;Sara A.Byron;;Pamela M.Pollock;;Seth J.Orlow.Anti-Cancer Drugs,2013(2)

[3]An ex vivo study of selenium,genistein on the morphological and nuclear changes in anticancer drug‐induced apoptosis in human peripheral blood lymphocytes[J].Elango Sonaa;;Subbiah Usha;;Jeong Ja In.BioFactors,2013(3)

[4]Evaluation of pleural fluid survivin and XIAP for the diagnosis of malignant pleural effusion[J].Jian Li;;Zhen-Nan Li;;Qian-Lei Bao;;Li-Ping Ge;;Xiao-Qin Li;;Ping Chen.Tumor Biology,2012(5)

[5]王云霞.XAF1在卵巢癌组织中的表达及作用机制的实验研究[D].山东大学,2013.