ICOS抗体的应用

背景^[1-3]

ICOS抗体是一种可以特异性结合ICOS的人工合成抗体，可以靶向结合人、小鼠、大鼠和猪样品中的ICOS蛋白。ICOS抗体可用于多种科学应用，包括Western Blot、免疫组织化学、免疫细胞化学、免疫沉淀和ELISA。

诱导性T细胞共刺激因子（ICOS，CD278）是一种激活性共刺激免疫检查点，在活化的T细胞上表达。可诱导T细胞的增殖、存活和分化，并调节多种T细胞功能。其配体ICOSL在抗原呈递细胞和体细胞上表达，包括肿瘤微环境中的肿瘤细胞。ICOS与其配体的结合触发下游通路，从而调节T细胞增殖和存活，ICOS可作为预测和监测T细胞介导的免疫治疗反应的生物标志物。

ICOS抗体

ICOS抗体使用步骤（Western Blot）：

1.样本制备

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-细胞/组织裂解液缓冲液），混匀。

2）贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g离心3-5min，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白电泳

1）取出预制胶，将预制胶固定在电泳槽中，内槽加满tris-glycine电泳缓冲液。

2）在室温或不超过37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上样缓冲液。水浴溶解后立即室温存放。

3）混合蛋白样品和5XSDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

4）100℃或沸水浴加热3-5min，以充分变性蛋白，之后冷却至室温备用。

5）上样蛋白，并在1个孔中上样蛋白marker，盖上电泳槽盖，打开电源，电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。

6）电泳后取出胶板，用刀在侧边硅胶处，沿着两片玻璃缝隙切开硅胶，即可打开玻璃板；取胶时。

3.转膜与封闭

1）将胶浸于预冷的转膜缓冲液中平衡5min。

2）依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入预冷的转膜缓冲液中平衡10min，如用PVDF膜，需参照说明书，先用纯甲醇浸泡1-2min，再孵育于预冷的转膜缓冲液中。

3）装配转移三明治：海绵/3层滤纸/胶/膜/3层滤纸/海绵，每层放好后，用试管赶尽气泡。

4）将转移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近阳极，胶靠近阴极，加入转移缓冲液，插上电极，100V，1h（电流约为0.3A）。

5）转膜结束后，切断电源，取出膜。

6）将膜浸没在5mL丽春红染色液中，置于轨道摇床上室温染色5~10min或更长，直待膜上显示出蛋白条带。

7）清洗：取出膜，用蒸馏水，PBS或者其他适当溶液冲洗至背景清晰后拍照，大概冲洗2~3次，每次5min。

8）脱色：将膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脱液，再重复一次。

9）清洗：再用蒸馏水清洗膜2~3次，每次5min。

10）将膜置于25mL封闭缓冲液中，在室温下孵育1小时。

11）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

4.抗体孵育与检测

1）将膜和一抗（ICOS抗体按照产品应用推荐稀释度）置于10mL一抗稀释缓冲液中在4℃下孵育过夜并不时轻轻晃动。

2）用5mL TBST洗涤三次，每次15min以去除残留的一抗(ICOS抗体)。

3）将膜和二抗（按照产品应用推荐稀释度）置于10mL封闭缓冲液中孵育1-2小时并不时轻轻晃动。

4）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同时，按照ECL超敏试剂盒说明书，新鲜配制发光工作液。

6）用平头镊取出膜，搭在滤纸上沥干洗液。将膜完全浸入发光工作液中，与发光工作液充分接触。室温孵育3min，准备立即压片曝光。但勿洗去发光液。

7）显影曝光。

应用^[4][5]

ICOS抗体可以用于狼疮肾炎患者外周血淋巴细胞上ICOS/B7RP-1的表达及激素的影响

比较狼疮肾炎(lupus nephritis,LN)患者、无肾脏损害的系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)患者和正常对照外周血T、B淋巴细胞上ICOS/B7RP-1的表达,分析ICOS/B7RP-1表达与临床活动指标的关联以及激素对其表达的影响。

方法:病例来自安徽医科大学附属省立医院风湿科和肾内科门诊及住院部,LN患者、非LN患者以性别、年龄匹配,同时抽取匹配的健康体检者为健康对照,参照系统性红斑狼疮疾病活动指数(systemic lupus erythematosus disease activity index,SLEDAI)量表设计调查问卷,收集患者疾病活动度情况和实验室资料。运用ICOS抗体三色流式细胞术,检测LN患者、非LN患者和正常对照记忆性T淋巴细胞(CD4+CD45RO+、CD8+CD45RO+)上ICOS的表达及原始B细胞(CD19+CD27-)、记忆性B细胞(CD19+CD27+)、浆细胞(CD19+CD27++)上B7RP-1的表达。分离ICOS表达较高患者的外周血淋巴细胞,适量激素刺激培养,判断激素对ICOS/B7RP-1表达的影响。

ICOS抗体结果:LN患者和非LN患者CD4+CD45RO+T细胞和CD8+CD45RO+T细胞ICOS的表达均高于正常对照,LN患者ICOS表达高于非LN患者(CD4:F=28.10,P<0.05;CD8:F=20.87,P<0.05),但ICOS的表达水平与SLEDAI关联无统计学意义(CD4:r=0.16,P>0.05;CD8:r=0.26,P>0.05)。LN患者和非LN患者浆细胞占B淋巴细胞比例较正常对照增加,且LN患者高于非LN患者(F=46.59,P<0.05);LN患者和非LN患者记忆性B淋巴细胞占B淋巴细胞比例低于正常对照,但LN患者与非LN患者差异无统计学意义(F=6.40,P<0.05);LN患者、非LN患者和正常对照三组原始B淋巴细胞占B淋巴细胞比例差异无统计学意义。LN患者和非LN患者B淋巴细胞B7RP-1表达均低于正常人,但LN患者和非LN患者B7RP-1表达差异无显著性(F=30.02,P<0.05),B7RP-1的表达与SLEDAI关联无统计学意义(r=0.04 P>0.05)。激素刺激外周血淋巴细胞,CD4+CD45RO+和CD8+CD45RO+T淋巴细胞上ICOS的表达降低(CD4:F=11.94,P<0.05;CD8:F=34.41,P<0.05),B淋巴细胞上B7RP-1的表达下降(F=16.12,P<0.05)。

参考文献

[1]Role of inducible costimulator in the development of lupus in MRL/lpr mice[J].Yoshifumi Tada;;Syuichi Koarada;;Yoshiyuki Tomiyoshi;;Fumitaka Morito;;Mio Mitamura;;Yoshio Haruta;;Akihide Ohta;;Kohei Nagasawa.Clinical Immunology,2006(2)

[2]Regulation of T:B cell interactions by the Inducible Costimulator molecule:Does ICOS“induce”disease?[J].Rebecca A.Shilling;;Hozefa S.Bandukwala;;Anne I.Sperling.Clinical Immunology,2006(1)

[3]Eminent role of ICOS costimulation for T cells interacting with plasmacytoid dendritic cells[J].MarkoJanke;Esther J.Witsch;Hans W.Mages;AndreasHutloff;Richard A.Kroczek.Immunology,2006(3)

[4]B cell abnormality and autoimmune disorders[J].Takeshi Tsubata.Autoimmunity,2005(5)

[5]陈国平.狼疮肾炎患者外周血淋巴细胞上ICOS/B7RP-1的表达及激素的影响[D].安徽医科大学,2009.