TIE-2抗体的应用

背景^[1-3]

TIE-2抗体是一种IgG2aκ小鼠单克隆Tie-2抗体（也称为TIE2抗体、TEK抗体或TEK受体酪氨酸激酶抗体），可通过WB、IP和ELISA检测小鼠、大鼠和人源的Tie-2蛋白。Tie-2抗体（3A5）以非偶联型抗Tie-2抗体的形式提供。受体酪氨酸激酶在生物系统（包括血管系统）中的细胞表面信号转导中起关键作用。这些受体由大量且多样的催化相关蛋白家族组成，根据序列和结构相似性，可分为几个不同的进化亚家族。据报道，Tie-1（也称为Tie）是一种新型的人内皮细胞表面受体酪氨酸激酶，已被克隆和表征。预测的Tie-1蛋白产物的细胞外域具有不寻常的多域结构，该结构由三个表皮生长因子同源基序组成，这些基序位于两个免疫球蛋白样环之间，后者紧接着跨膜区域旁边的三个纤连蛋白III型重复序列。该家族的另一个成员已被鉴定为Tie-2（也称为Tek）。Tie-1和Tie-2已被证明由不同的基因编码，并代表新型受体酪氨酸激酶的成员。

TIE-2抗体

TIE-2抗体使用步骤（Western Blot）：

1.样本制备

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-细胞/组织裂解液缓冲液），混匀。

2）贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g离心3-5min，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白电泳

1）取出预制胶，将预制胶固定在电泳槽中，内槽加满tris-glycine电泳缓冲液。

2）在室温或不超过37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上样缓冲液。水浴溶解后立即室温存放。

3）混合蛋白样品和5XSDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

4）100℃或沸水浴加热3-5min，以充分变性蛋白，之后冷却至室温备用。

5）上样蛋白，并在1个孔中上样蛋白marker，盖上电泳槽盖，打开电源，电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。

6）电泳后取出胶板，用刀在侧边硅胶处，沿着两片玻璃缝隙切开硅胶，即可打开玻璃板；取胶时。

3.转膜与封闭

1）将胶浸于预冷的转膜缓冲液中平衡5min。

2）依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入预冷的转膜缓冲液中平衡10min，如用PVDF膜，需参照说明书，先用纯甲醇浸泡1-2min，再孵育于预冷的转膜缓冲液中。

3）装配转移三明治：海绵/3层滤纸/胶/膜/3层滤纸/海绵，每层放好后，用试管赶尽气泡。

4）将转移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近阳极，胶靠近阴极，加入转移缓冲液，插上电极，100V，1h（电流约为0.3A）。

5）转膜结束后，切断电源，取出膜。

6）将膜浸没在5mL丽春红染色液中，置于轨道摇床上室温染色5~10min或更长，直待膜上显示出蛋白条带。

7）清洗：取出膜，用蒸馏水，PBS或者其他适当溶液冲洗至背景清晰后拍照，大概冲洗2~3次，每次5min。

8）脱色：将膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脱液，再重复一次。

9）清洗：再用蒸馏水清洗膜2~3次，每次5min。

10）将膜置于25mL封闭缓冲液中，在室温下孵育1小时。

11）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

4.抗体孵育与检测

1）将膜和一抗（TIE-2抗体按照产品应用推荐稀释度）置于10mL一抗稀释缓冲液中在4℃下孵育过夜并不时轻轻晃动。

2）用5mL TBST洗涤三次，每次15min以去除残留的一抗(TIE-2抗体)。

3）将膜和二抗（按照产品应用推荐稀释度）置于10mL封闭缓冲液中孵育1-2小时并不时轻轻晃动。

4）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同时，按照ECL超敏试剂盒说明书，新鲜配制发光工作液。

6）用平头镊取出膜，搭在滤纸上沥干洗液。将膜完全浸入发光工作液中，与发光工作液充分接触。室温孵育3min，准备立即压片曝光。但勿洗去发光液。

7）显影曝光。

应用^[4][5]

TIE-2抗体可以用于DCE-MRI评价可溶性Tie2抗体抗SCID小鼠肺癌皮下移植瘤新生血管的疗效的研究

动态增强磁共振成像(dynamic contrast-enhanced MRI,DCE-MRI)是通过跟踪静脉内所注射的对比剂通过血管的药代动力学特征无创地评价组织和肿瘤血管结构和功能特性的一种功能性成像方法。作为一种比较新颖的成像技术,它能无创地显示微血管结构,并能测量血管渗透性、血管内外血容量和血流量的变化。目前已被广泛的应用于活体监测肿瘤的新生血管并对肿瘤血管药物的疗效进行良好评价。

DCE-MRI评价可溶性Tie2抗体抗SCID小鼠肺癌皮下移植瘤新生血管的疗效的实验研究目的探讨可溶性Tie2对SCID小鼠肺癌皮下移植瘤新生血管的抑制作用.方法建立SCID小鼠肺癌皮下移植瘤模型,接种LLC细胞第2天,小鼠随机分为AdExTeK、AdAng1、AdLacZ(对照组)3组,经尾静脉注入分别携带可溶性Tie2、LacZ、Ang1基因的腺病毒溶液(AdExTeK、AdAng、1 AdLacZ),接种8天及2周后分别对肿瘤进行DCE-MRI扫描,比较三组间肿瘤血管的功能参数的差别,扫描结束后将肿瘤进行病理切片,用TIE-2抗体进行免疫组化染色,将免疫组化病理图片与DCE-MRI结果进行比较。

TIE-2抗体结果动物接种8天后,采用非参数检验,与对照组AdLacZ组比较,AdExTeK组DCE-MRI所得4项血管功能参数Ktrans、Kep、Ve、iAUC均低于对照组,差别具有统计学意义(P<0.05),AdAngl组Ktrans、Kep高于对照组,差别具有统计学意义(P<0.05),三组肿瘤体积未见明显差别；2周后,AdExTeK组Ktrans、Kep、Ve、iAUC均低于对照组,差别具有统计学意义(P<0.05)。免疫组化病理图片显示AdExTeK组血管密度较对照组小,与DCE-MRI扫描结果具有一致性。

参考文献

[1]The Distribution of Angiopoietin-1,Angiopoietin-2 and Their Receptors Tie-1 and Tie-2 in the Very Early Human Placenta[J].Y.Seval;;L.Sati;;C.Celik-Ozenci;;O.Taskin;;R.Demir.Placenta,2008(9)

[2]AZD2171,a Pan-VEGF Receptor Tyrosine Kinase Inhibitor,Normalizes Tumor Vasculature and Alleviates Edema in Glioblastoma Patients[J].Tracy T.Batchelor;;A.Gregory Sorensen;;Emmanuelle di Tomaso;;Wei-Ting Zhang;;Dan G.Duda;;Kenneth S.Cohen;;Kevin R.Kozak;;Daniel P.Cahill;;Poe-Jou Chen;;Mingwang Zhu;;Marek Ancukiewicz;;Maciej M.Mrugala;;Scott Plotkin;;Jan Drappatz;;David N.Louis;;Percy Ivy;;David T.Scadden;;Thomas Benner;;Jay S.Loeffler;;Patrick Y.Wen;;Rakesh K.Jain.Cancer Cell,2007(1)

[3]Comparison of the Performance of Tracer Kinetic Model-Driven Registration for Dynamic Contrast Enhanced MRI Using Different Models of Contrast Enhancement[J].Giovanni A.Buonaccorsi;;Caleb Roberts;;Sue Cheung;;Yvonne Watson;;James P.B.O’Connor;;Karen Davies;;Alan Jackson;;Gordon C.Jayson;;Geoff J.M.Parker.Academic Radiology,2006(9)

[4]Biomarkers for assessment of pharmacologic activity for a vascular endothelial growth factor(VEGF)receptor inhibitor,PTK787/ZK 222584(PTK/ZK):translation of biological activity in a mouse melanoma metastasis model to phase I studies in patients with advanced colorectal cancer with liver metastases[J].Lucy Lee;;Sunil Sharma;;Bruno Morgan;;Peter Allegrini;;Christian Schnell;;Josef Brueggen;;Robert Cozens;;Mark Horsfield;;Clemens Guenther;;Will P.Steward;;Joachim Drevs;;David Lebwohl;;Jeanette Wood;;Paul M.J.McSheehy.Cancer Chemotherapy and Pharmacology,2006(6)

[5]常双会.DCE-MRI评价可溶性Tie2抗体抗SCID小鼠肺癌皮下移植瘤新生血管的疗效的研究[D].南方医科大学,2010.