S-TAG抗体的应用

背景^[1-3]

S-TAG抗体以KLH偶联的S-tag为免疫原，并经抗原亲和纯化，可满足多种应用需求，包括蛋白印迹(WB)、免疫沉淀(IP)和免疫荧光(IF)实验。

S-tag(氨基酸序列:KETAAAKFERQHMDS)是一段来源于胰腺核糖核酸酶A(RNase A)N末端的短肽。通常将S-tag构建到目的蛋白的N末端或C末端上，以便可以使用免疫化学方法分析S-tag标记的蛋白。这种S-tag蛋白可通过商业化的S-tag抗体检测。

S-TAG抗体

S-TAG抗体使用步骤（Western Blot）：

1.样本制备

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-细胞/组织裂解液缓冲液），混匀。

2）贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g离心3-5min，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白电泳

1）取出预制胶，将预制胶固定在电泳槽中，内槽加满tris-glycine电泳缓冲液。

2）在室温或不超过37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上样缓冲液。水浴溶解后立即室温存放。

3）混合蛋白样品和5XSDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

4）100℃或沸水浴加热3-5min，以充分变性蛋白，之后冷却至室温备用。

5）上样蛋白，并在1个孔中上样蛋白marker，盖上电泳槽盖，打开电源，电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。

6）电泳后取出胶板，用刀在侧边硅胶处，沿着两片玻璃缝隙切开硅胶，即可打开玻璃板；取胶时。

3.转膜与封闭

1）将胶浸于预冷的转膜缓冲液中平衡5min。

2）依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入预冷的转膜缓冲液中平衡10min，如用PVDF膜，需参照说明书，先用纯甲醇浸泡1-2min，再孵育于预冷的转膜缓冲液中。

3）装配转移三明治：海绵/3层滤纸/胶/膜/3层滤纸/海绵，每层放好后，用试管赶尽气泡。

4）将转移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近阳极，胶靠近阴极，加入转移缓冲液，插上电极，100V，1h（电流约为0.3A）。

5）转膜结束后，切断电源，取出膜。

6）将膜浸没在5mL丽春红染色液中，置于轨道摇床上室温染色5~10min或更长，直待膜上显示出蛋白条带。

7）清洗：取出膜，用蒸馏水，PBS或者其他适当溶液冲洗至背景清晰后拍照，大概冲洗2~3次，每次5min。

8）脱色：将膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脱液，再重复一次。

9）清洗：再用蒸馏水清洗膜2~3次，每次5min。

10）将膜置于25mL封闭缓冲液中，在室温下孵育1小时。

11）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

4.抗体孵育与检测

1）将膜和一抗（S-TAG抗体按照产品应用推荐稀释度）置于10mL一抗稀释缓冲液中在4℃下孵育过夜并不时轻轻晃动。

2）用5mL TBST洗涤三次，每次15min以去除残留的一抗(S-TAG抗体)。

3）将膜和二抗（按照产品应用推荐稀释度）置于10mL封闭缓冲液中孵育1-2小时并不时轻轻晃动。

4）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同时，按照ECL超敏试剂盒说明书，新鲜配制发光工作液。

6）用平头镊取出膜，搭在滤纸上沥干洗液。将膜完全浸入发光工作液中，与发光工作液充分接触。室温孵育3min，准备立即压片曝光。但勿洗去发光液。

7）显影曝光。

应用^[4][5]

S-TAG抗体可以用于脂肪酸脱氢酶FAD2的原核表达及转基因小鼠的初步建立

构建一个肌肉组织特性的ω-6脂肪酸去饱和酶(脱氢酶)真核表达载体，通过原核显微注射法把棉花的ω-6脂肪酸去饱和酶导入到小鼠体内，以小鼠为动物模型，建立动物体内的必需脂肪酸合成代谢通路。同时构建一个ω-6脂肪酸去饱和酶的原核表达载体，通过原核表达来生产ω-6脂肪酸去饱和酶。使用得到的蛋白来生产抗体用于下一步表达检测的Western印迹试验。本实验以pEGFP-N1质粒为骨架载体，用酶切连接的方法构建一个顺序含有α-actin启动子、FAD2 cDNA、SV40 polyA加尾信号的真核表达载体，双切线性化后回收，使用回收的表达载体经原核显微注射生产转基因小鼠。采用聚合酶链式反应(PCR)和Southern印迹对阳性鼠进行检测。以PCR及酶切连接的方法构建一个含有FAD2 cDNA编码序列的原核表达载体，此蛋白的N端融合有S-tag标签，便于对表达的蛋白进行S-TAG抗体Southern印迹检测及纯化。经受精卵原核显微注射后移植到受体母鼠，第一批移植受体后产仔34只，经PCR检测阳性为3只。原核表达载体pETFAD2转化到表达菌株BL21(DE3)后，经IPTG诱导得到了目标蛋白。

参考文献

[1]Size Matters:Use of YACs,BACs and PACs in Transgenic Animals[J].Patricia Giraldo;;Lluís Montoliu.Transgenic Research,2001(2)

[2]Expression of human blood clotting factor VIII in the mammary gland of transgenic sheep[J].Heiner Niemann;;Roman Halter;;Joseph W.Carnwath;;Doris Herrmann;;Erika Lemme;;Dieter Paul.Transgenic Research,1999(3)

[3]Fatty acids and lipids from cell biology to human disease[J].Artemis P.Simopoulos;;Norman Salem.Lipids,1996(1)

[4]Role of essential fatty acids in the function of the developing nervous system[J].Ricardo Uauy;;Patricio Peirano;;Dennis Hoffman;;Patricia Mena;;David Birch;;Eileen Birch.Lipids,1996(1)

[5]王宇.脂肪酸脱氢酶FAD2的原核表达及转基因小鼠的初步建立[D].中国农业大学,2004.