OGG1抗体的应用

背景^[1-3]

OGG1抗体是无偶联基团的、靶向OGG1的IgG抗体，预测分子量为39 kDa(实际观测：39 kDa)。OGG1 Antibody可用于的Western Blot（WB）、免疫细胞化学（ICC）、ICC、ELISA及流式细胞术（FC）等实验。WB稀释倍数1:500-1:1000；ICC/IF稀释倍数1:100-1:500;IHC-Fr(冰冻切片)稀释倍数1:25-1:100;IP稀释倍数1:10-1:500;其他实验需要研究人员根据实际情况自行设置稀释倍数。

OGG1基因编码负责切除8-氧代鸟嘌呤的酶，8-氧代鸟嘌呤是一种因暴露于活性氧而发生的诱变碱基副产物。这种酶的作用包括用于链裂解的裂解酶活性。该基因C末端区域的选择性剪接将剪接变体分为两大类，即1型和2型，具体取决于序列的最后一个外显子。1型选择性剪接变体以外显子7结尾，2型以外显子8结尾。所有变体都共享共同的N端区域，其中包含对线粒体定位至关重要的线粒体靶向信号。已经描述了该基因的许多选择性剪接变体，但尚未确定每个变体的全长性质。

OGG1抗体

OGG1抗体使用步骤（Western Blot）：

1.样本制备

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-细胞/组织裂解液缓冲液），混匀。

2）贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g离心3-5min，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白电泳

1）取出预制胶，将预制胶固定在电泳槽中，内槽加满tris-glycine电泳缓冲液。

2）在室温或不超过37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上样缓冲液。水浴溶解后立即室温存放。

3）混合蛋白样品和5XSDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

4）100℃或沸水浴加热3-5min，以充分变性蛋白，之后冷却至室温备用。

5）上样蛋白，并在1个孔中上样蛋白marker，盖上电泳槽盖，打开电源，电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。

6）电泳后取出胶板，用刀在侧边硅胶处，沿着两片玻璃缝隙切开硅胶，即可打开玻璃板；取胶时。

3.转膜与封闭

1）将胶浸于预冷的转膜缓冲液中平衡5min。

2）依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入预冷的转膜缓冲液中平衡10min，如用PVDF膜，需参照说明书，先用纯甲醇浸泡1-2min，再孵育于预冷的转膜缓冲液中。

3）装配转移三明治：海绵/3层滤纸/胶/膜/3层滤纸/海绵，每层放好后，用试管赶尽气泡。

4）将转移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近阳极，胶靠近阴极，加入转移缓冲液，插上电极，100V，1h（电流约为0.3A）。

5）转膜结束后，切断电源，取出膜。

6）将膜浸没在5mL丽春红染色液中，置于轨道摇床上室温染色5~10min或更长，直待膜上显示出蛋白条带。

7）清洗：取出膜，用蒸馏水，PBS或者其他适当溶液冲洗至背景清晰后拍照，大概冲洗2~3次，每次5min。

8）脱色：将膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脱液，再重复一次。

9）清洗：再用蒸馏水清洗膜2~3次，每次5min。

10）将膜置于25mL封闭缓冲液中，在室温下孵育1小时。

11）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

4.抗体孵育与检测

1）将膜和一抗（OGG1抗体按照产品应用推荐稀释度）置于10mL一抗稀释缓冲液中在4℃下孵育过夜并不时轻轻晃动。

2）用5mL TBST洗涤三次，每次15min以去除残留的一抗(OGG1抗体)。

3）将膜和二抗（按照产品应用推荐稀释度）置于10mL封闭缓冲液中孵育1-2小时并不时轻轻晃动。

4）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同时，按照ECL超敏试剂盒说明书，新鲜配制发光工作液。

6）用平头镊取出膜，搭在滤纸上沥干洗液。将膜完全浸入发光工作液中，与发光工作液充分接触。室温孵育3min，准备立即压片曝光。但勿洗去发光液。

7）显影曝光。

应用^[4][5]

OGG1抗体可以用于OGG1在氧化应激引起的细胞死亡中的作用及机制研究

8-羟基鸟嘌呤糖苷酶1（OGG1）是真核细胞识别并切除8-oxoG的特异性DNA修复酶,通过自然界中极为保守的碱基切除修复途径对8-oxoG进行修复。但OGG1开启的碱基切除修复（OGG1-BER）在氧化应激引起的细胞死亡过程中的作用研究甚少。OGG1-BER过程的中间产物包括AP位点和链的断裂,而这两种产物恰好是DNA损伤修复效应蛋白PARP1活化的底物。PARP1的过度活化会触发AIF介导的caspase-非依赖的细胞死亡（parthanatos）。因此,我们推测,过度氧化应激时,OGG1-BER与parthanatos有密切的联系,OGG1-BER过程产生的AP位点以及链的断裂是PARP1过度活化以及细胞死亡的原因。

9-本研究首先利用H2O2刺激小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）模拟氧化应激过程,明确了H2O2诱导的细胞死亡是parthanatos死亡途径。其次,我们利用野生型MEF细胞(Ogg1+/+)和Ogg1敲除型的MEF细胞(Ogg1-/-),si RNA干扰OGG1表达以及过表达OGG1来探究OGG1在parthanatos中的作用。OGG1抗体实验结果表明,OGG1能加剧氧化应激触发的parthanatos。

10-利用OGG1催化活性位点突变质粒结合免疫荧光,TUNEL,OGG1抗体流式细胞术实验分析是否是由于OGG1-BER活性促进parthanatos过程。实验结果表明,OGG1-BER过程的确能增加链断裂,PARP1活化,AIF的入核以及细胞死亡。最后,我们利用NMDA刺激神经细胞模拟parthanatos过程,探究OGG1在细胞死亡中的生理及病理意义。OGG1抗体结果表明,NMDA诱导神经细胞parthanatos过程中会产生大量ROS和8-oxoG,OGG1的存在确实能加剧细胞死亡。综上所述,本研究证明了过度氧化应激时,OGG1-BER过程中修复中间产物（AP位点和链的断裂）是PARP1的过度活化的主要原因。PARP1的过度活化促进AIF从线粒体释放进入细胞核触发parthanatos。本研究初步提示DNA损伤修复与细胞死亡之间的密切联系。同时也揭示了OGG1-BER依据氧化应激程度不同触发不同的细胞生物学事件,轻度氧化应激时,OGG1能识别切除8-oxoG,清除机体氧化的碱基,维持基因组的完整性;而过度氧化应激时,OGG1-BER产生修复中间体促进PARP1的活化,AIF的入核并进一步触发细胞程序性死亡-parthanatos,进而维持机体的稳态,防止细胞恶化。

参考文献

[1]8-Oxoguanine DNA glycosylase 1:Beyond repair of the oxidatively modified base lesions[J].Xueqing Ba;;Istvan Boldogh.Redox Biology,2018

[2]Unveiling the non-repair face of the Base Excision Repair pathway in RNA processing:A missing link between DNA repair and gene expression?[J].Giulia Antoniali;;Matilde Clarissa Malfatti;;Gianluca Tell.DNA Repair.2017

[3]8-Oxo-7,8-dihydroguanine,friend and foe:Epigenetic-like regulator versus initiator of mutagenesis[J].Aaron M.Fleming;;Cynthia J.Burrows.DNA Repair.2017

[4]JNK Activation Contributes to Oxidative Stress-Induced Parthanatos in Glioma Cells via Increase of Intracellular ROS Production[J].Linjie Zheng;;Chen Wang;;Tianfei Luo;;Bin Lu;;Hongxi Ma;;Zijian Zhou;;Dong Zhu;;Guangfan Chi;;Pengfei Ge;;Yinan Luo.Molecular Neurobiology,2017(5)

[5]王若曦.OGG1在氧化应激引起的细胞死亡中的作用及机制研究[D].东北师范大学,2018.