人NOD样受体(NLR)Elisa试剂盒的应用

背景^[1-3]

人NOD样受体(NLR)Elisa试剂盒是一种通过酶联免疫技术（Elisa）原理特异性识别样本中人NOD样受体(NLR)的商品化试剂盒。人NOD样受体(NLR)Elisa试剂盒可以通过识别样本中人NOD样受体(NLR)的类别及含量为科研及临床诊断提供依据。

需要注意的是若用于临床诊断的Elisa试剂盒需取得上市所在国的医疗器械资质。同时人NOD样受体(NLR)Elisa试剂盒的诊断结论存在一定的局限性，受限于样本保存不当、实验操作不规范，方法学灵敏度等原因不能作为临床判断的唯一依据。

人NOD样受体(NLR)Elisa试剂盒技术原理：ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)方法的基本原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。此种酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应。因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。此种显色反应可通过ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)方法成为一种既特异又敏感的检测方法。

人NOD样受体(NLR)Elisa试剂盒

人NOD样受体(NLR)Elisa试剂盒样品收集、处理及保存方法:

1.血清:使用不含热原和内毒素的试管,操作过程中避免任何细胞刺激,收集血液后,3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。

2.血浆:EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。

3.细胞上清液:3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。

4.组织匀浆:将组织加入适量生理盐水捣碎。3000转离心10分钟取上清。

5.保存:如果样本收集后不及时检测,请按一次用量分装,冻存于-20℃,避免反复冻融,在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

人NOD样受体(NLR)Elisa试剂盒操作流程如下:

(1)待测样品孔中每孔加入待测样品100μl,每种样品设3个平行孔;设两个阴性对照孔,每孔加未处理组的细胞裂解液100μl;另设一个空白对照孔,加入纯细胞裂解液100μl。

(2)酶标板置4℃,包被过夜。

(3)洗板:吸干孔内反应液,用洗涤液过洗一遍(将洗涤液注满板孔后,即甩去),之后将洗涤液注满板孔,浸泡1-2分钟,间歇摇动。甩去孔内液体后在吸水纸上拍干。重复洗涤3-4次。

(4)阴性对照孔每孔加入PBS 50μl,样品孔及空白孔每孔加入1:500稀释的抗体工作液50μl。

(5)酶标板置37℃培养箱的湿盒内,孵育60min。

(6)洗板,同(4)。

(7)每孔加1:5000稀释的抗体工作液100μl。

(8)酶标板置37℃培养箱的湿盒内,孵育60min。

(9)洗板,同(4)。

(10)每孔加TMB显色液100μl,轻轻混匀10s,置37℃暗处反应15-20min。

(11)每孔加100μl 2mol/L H2SO4终止反应。

(12)分别测450nm吸光值W1和630nm吸光值W2,测得的OD值为两者之差(W1-W2),以减少由容器上的划痕或指印等造成的光干扰。

(13)数据处理:在得出标本(S)和阴性对照(N)的OD值后,计算S/N值。

应用^[4][5]

人NOD样受体(NLR)Elisa试剂盒可以用于Nods样模式识别受体在变应性鼻炎患者鼻黏膜中的表达及意义

探讨Nods(核苷酸结合寡聚化结构域,Nod Like receptors)样模式识别受体(PRR)在变应性鼻炎患者下鼻甲黏膜组织中的表达及作用,并研究变应性鼻炎下鼻甲黏膜IL-4、IL-6、IL-10、IFN-r的表达情况,以鼻中隔偏曲患者下鼻甲黏膜、鼻息肉做对照。提取变应性鼻炎外周血单个核细胞,比较变应性鼻炎患者脱敏治疗6个月前后单个核细胞Nod1表达的变化,及脱敏治疗前后血清、鼻分泌物中IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ变化情况,探索Nodl表达变化和细胞因子变化之间的关系。

方法:2011年9月至2012年9月在南方医科大学珠江医院门诊变应性鼻炎(AR)患者,根据AIRA2010(依据临床表现、鼻腔检查情况、皮肤点刺实验结果或血清变应原特异性IgE检测)入组；对照组1：期间因鼻中隔偏曲行单纯鼻中隔偏曲矫正术患者；对照组2：慢性鼻窦炎伴鼻息肉(CRSwNP,chronic rhinosinusitis with nasal polyps)住院患者(根据EPOS2007指南标准纳入研究组)。本项研究得到了南方医科大学珠江医院伦理委员会的批准,且征得所有研究对象知情签字同意。分别采用real-time RT-PCR、人NOD样受体(NLR)Elisa试剂盒、western-blot及免疫组织化学检测Nod1、od2、NALP3mRNA及蛋白在变应性鼻炎患者下鼻甲黏膜(患者下鼻甲黏膜,以下简称黏膜)表达,以鼻中隔偏曲患者代偿侧下鼻甲黏膜、鼻息肉粘膜做对照。人NOD样受体(NLR)Elisa试剂盒测变应性鼻炎黏膜(组织匀浆液)IL-4、L-6、IL-10、IFN-γ的表达量,以鼻中隔偏曲下鼻甲黏膜,鼻息肉组织做对照。western-blot测变应性鼻炎患者舌下特异性免疫脱敏治疗6个月前后外周血单个核细胞Nod1的表达变化。人NOD样受体(NLR)Elisa试剂盒ELISA测变应性鼻炎患者脱敏治疗6个月前后血清、鼻腔分泌物IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ表达变化。

人NOD样受体(NLR)Elisa试剂盒结果：1.Real-Time RT-PCR显示：变应性鼻炎黏膜组织Nod1mRNA表达较正常对照下鼻甲粘膜、鼻息肉均低(P=0.31,P=0.00),NALP3mRNA表达较正常对照下鼻甲粘膜、鼻息肉均高(P=0.01,P=0.01),Nod2mRNA表达与正常对照下鼻甲粘膜、鼻息肉比较无明显差别,差异无统计学意义(P=0.06,P=0.10)。2.western-blot结果提示：变应性鼻炎黏膜组织Nod1表达低于正常对照下鼻甲粘膜、鼻息肉组(均为P=0.00),NALP3高于正常对照下鼻甲粘膜、鼻息肉(均为P=0.00),Nod2三组之间差异无统计学意义(P=0.52,P=0.29)。3.免疫组织化学表明,三种模式受体在三组中均有表达,主要表达于上皮细胞、腺体上皮、炎性细胞(如浆细胞、嗜酸性粒细胞),变应性鼻炎黏膜组织Nod1表达较正常对照下鼻甲粘膜、鼻息肉均低(P=0.01,P=0.00),NALP3表达较较正常对照下鼻甲粘膜、鼻息肉均高(P=0.01,P=0.01),Nod2蛋白表达三组之间差异无统计学意义(P=0.14)。

参考文献

[1]NOD1 and NOD2 stimulation triggers innate immune responses of humanperiodontal ligament cells[J].Do-In Jeon;;Se-Ra Park;;Mee-Young Ahn;;Sang-Gun Ahn;;Jong-Hwan Park;;Jung-Hoon Yoon.International Journal of Molecular Medicine,2012(4)

[2]Pattern‐recognition receptors in human eosinophils[J].Anne M?nssonKvarnhammar;Lars OlafCardell.Immunology,2012(1)

[3]Therapeutic Effects and Biomarkers in Sublingual Immunotherapy:A Review[J].Takashi Fujimura;;Yoshitaka Okamoto;;Masaru Taniguchi;;Nerin N.Bahceciler.Journal of Allergy,2012

[4]New Methods of Prevention and Treatment of Allergic Diseases[J].David El-Qutob Lopez.Recent Patents on InflammationandAllergy Drug Discovery,2012(1)

[5]张沈华.Nods样模式识别受体在变应性鼻炎患者鼻黏膜中的表达及意义[D].南方医科大学,2013.